劉靖靖，趙晶，田瑩瑩，陳明，王瑞琦

1(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連，116034)

2(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連，116600)

鄰苯二甲酸酯(Phthalates，PAEs)是工業(yè)上被廣泛使用的高分子材料助劑，在塑料中加入該物質(zhì)，可增強產(chǎn)品的透明度、柔韌性和可塑性［1－2］。PAEs的分子結(jié)構(gòu)與生物激素類似，痕量的PAEs可通過飲水、呼吸、皮膚接觸等方式進入人體，影響人體內(nèi)激素含量，導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)［3］。若長期食用含PAEs的食品會造成生殖系統(tǒng)異常甚至致癌、致畸的危險，因此PAEs不能添加在食物中和用于生產(chǎn)食品包裝材料［4－6］。許多國家已將PAEs列入優(yōu)先監(jiān)測的黑名單中，例如，美國國家環(huán)保署將鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)和鄰苯二甲酸二辛酯(DNOP)6種PAEs列為優(yōu)先控制污染物［7］，并規(guī)定在飲水中 DEHP 的最大允許濃度為 6 μg/L［8－9］;我國在水中優(yōu)先控制污染物名單中列入了DMP、DBP和 DEHP［10］;歐盟規(guī)定 DBP、BBP、DEHP 的特定遷移量分別低于0.3、30和1.5 mg/L。

近年來，公眾十分關(guān)注 PAEs導(dǎo)致的食品污染［11－12］，啤酒作為世界上最普遍的酒精飲料，其中PAEs的殘留也是消費者健康的安全隱患，因此檢測和控制啤酒中PAEs含量具有重要意義。然而，目前我國并沒有專門針對啤酒中PAEs的檢測標準，相關(guān)酒類檢測均采用國家頒布的食品中PAEs的檢測標準，即GB/T21911－2008《食品中鄰苯二甲酸酯的測定》，但有文獻指出該標準對酒樣中PAEs的檢測結(jié)果并不穩(wěn)定、回收率較低［13－14］。同時針對啤酒樣品中溶解有CO2氣體以及樣品成分復(fù)雜等特點，會對PAEs的測定結(jié)果造成干擾，并且啤酒樣品在萃取過程中會發(fā)生嚴重的乳化現(xiàn)象，造成測定時間長、回收率低，甚至無法檢測。因此，建立一種干擾性小、重現(xiàn)性好、準確快速的啤酒中PAEs測定方法，成為目前亟待解決的問題。

本文采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法(GC/MS)測定啤酒中的PAEs，對啤酒樣品中干擾因素(溶有CO2、成分復(fù)雜、易乳化)的消除方法進行探討，并對標準曲線的線性范圍、加標回收率、方法重現(xiàn)性等各項驗證指標進行研究，證明方法的可行性，建立了啤酒中PAEs的GC-MS測定方法。對市售啤酒中PAEs的檢測結(jié)果表明，該方法針對性強、靈敏度高、簡便快捷。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器:美國Perkinelmer Clarus SQ 8T氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀;德國IKA VORTEX Genius3漩渦振蕩器;德國SIGMA 3K15臺式離心機;美國 BRANSON 5510E-DTH臺式超聲水浴鍋。

試劑:12種塑化劑的混合標準溶液(色譜純)，上海安普科學(xué)儀器有限公司;正己烷(色譜純)，賽默飛世爾科技有限公司;NaCl(分析純);市售啤酒。

1.2 色譜條件

(1)氣相色譜條件

色譜柱:Elite 5MS(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm);進樣口溫度:280℃;載氣:氦氣(純度≥99.99%);流速:1 mL/min;進樣量:1 μL;分流方式:不分流;柱溫采取程序升溫:60℃維持1 min，以20℃/min升溫至220℃，維持1 min，以5℃/min升溫至280℃，維持8 min。

(2)質(zhì)譜條件

傳輸線溫度:250℃;離子源溫度:250℃;質(zhì)量掃描范圍:40～450 m/z;電離方式EI;電離能量70 eV;溶劑延遲5 min。采用選擇離子掃描(SIM)模式，定性定量離子見表1。

1.3 12種PAEs標準曲線的建立

將12種PAEs的混合標準溶液用正己烷稀釋至不同質(zhì)量濃度梯度(5、10、20、50、100、200、500 μg/L)，以SIM模式掃描進行GC-MS分析測定。以定量離子的峰面積為縱坐標，以PAEs化合物的濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.4 樣品處理

取混合均勻液體試樣5.0 mL，超聲振蕩5 min以除去CO2及其不穩(wěn)定成分，加入正己烷2 mL，NaCl 1.2 g，漩渦混合2 min，超聲提取15 min，靜置分層，取上清液進行GC-MS分析?？瞻讓φ胀瑯悠诽幚?。

表1 12種PAEs的保留時間和特征離子Table 1 Retention time and characteristic ions of 12 PAEs

2 結(jié)果與分析

2.1 定性測定

12種PAEs的混合標準溶液、啤酒樣品按實驗條件測定，GC/MS選擇離子流圖譜如圖1、圖2所示。

圖1 12種PAEs標準品的選擇離子色譜圖(質(zhì)量濃度為100 μg/L)Fig.1 Extracted ion chromatograph profile for twelve PAEs standards at 100 μg/L

圖2 啤酒樣品的選擇離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograph profile for a beer sample

對比兩圖可知，啤酒樣品與PAEs標準品的選擇離子色譜峰保留時間一致，峰形尖銳對稱，進一步對質(zhì)譜圖驗證發(fā)現(xiàn)對應(yīng)的質(zhì)譜碎片離子的質(zhì)荷比與標準品一致，且其相對豐度在允許偏差之內(nèi)。說明定性分析可靠，即可用于判斷啤酒樣品中是否存在該種PAEs。

2.2 定量分析

將配制好的7個濃度梯度的PAEs混合標準溶液，在給定條件下測定，測定結(jié)果以定量離子峰面積Y對濃度X進行線性回歸，其線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、相對標準偏差(RSD)、方法檢出限如表2所示。結(jié)果表明，12種PAEs回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)均在0.995 6以上，線性良好，滿足測定要求。根據(jù)空白樣品加標實驗來測定信噪比(S/N)，以S/N=3時的濃度為檢出限，其值均小于0.4 μg/L;以S/N=10時的濃度作為定量限，其值均小于4 μg/L，說明此線性范圍(5～500 μg/L)的最低質(zhì)量濃度高于定量限，故在線性范圍內(nèi)，物質(zhì)的定量準確。

表2 12種PAEs標準品的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、精密度Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients(r2)，RSD for twelve PAEs standards

2.3 樣品處理條件的優(yōu)化

采用GC/MS方法測定啤酒樣品中的PAEs，針對樣品中的干擾因素(溶有CO2、成分復(fù)雜、易乳化)，優(yōu)化了啤酒中PAEs測定的樣品處理條件，旨在建立萃取效率高、重現(xiàn)性好、操作簡便的PAEs測定方法。為實現(xiàn)該目標，主要從超聲處理時間和破乳方法選擇兩方面進行優(yōu)化，為了數(shù)據(jù)的準確性，每種方法均做了3個平行的加標試驗(加標質(zhì)量濃度為50 μg/L)，以加標回收率作為樣品處理條件的衡量指標。

2.3.1 不同破乳方法的選擇

啤酒樣品進行溶劑萃取時會發(fā)生嚴重的乳化現(xiàn)象，導(dǎo)致后續(xù)操作無法進行，為解決這一難題，本文通過對比不同消除乳化方法，比較不同方法下PAEs測定效果，以找到快速、有效的破乳方法。

取啤酒樣品，加正己烷萃取，發(fā)生嚴重的乳化現(xiàn)象，參照國標GB/T 21911－2008，經(jīng)4 000 r/min離心5 min后仍有嚴重凝固現(xiàn)象，而國標中對食品乳化現(xiàn)象這一難題的處理也只行至離心為止［15］，無法滿足啤酒樣品的后續(xù)檢測要求。本文在樣品萃取過程中，分別采用以下方法進行破乳:①靜置分層;②加入NaCl 1.2 g;③超聲15 min;④加入1.2 g NaCl并進行超聲15 min;⑤3 000 r/min離心10 min。檢測結(jié)果以響應(yīng)值、加標回收率表示，不同破乳方法對檢測結(jié)果的影響如表3和圖3所示。

對比不同破乳方法發(fā)現(xiàn)，1.從乳化分層時間來分析:(1)靜置2 h，難以分層;(2)樣品中加入NaCl，1 h后僅少量分層;(3)超聲15 min或加入NaCl并超聲15 min，明顯分層，以后者分層效果為佳;(4)離心10 min，明顯分層，但分界處有凝固現(xiàn)象。2.從平均響應(yīng)值來分析:方法②③⑤的響應(yīng)值均低于方法④的響應(yīng)值。3.從平均回收率來分析:加入NaCl的加標回收率過低，均小于78%;超聲或離心處理可提高加標回收率，但仍有部分PAEs的回收率低于70%;加入NaCl并超聲處理的加標回收率達86.33%～99.55%，大大提高了加標回收率。加入NaCl可以降低有機物和萃取溶劑在水相中的溶解度，有利于萃取效率的提高，并且在超聲協(xié)助萃取條件下，實現(xiàn)了水相與有機相的破乳快速分層，萃取效率大幅度提高。故選擇加入NaCl并超聲處理作為最優(yōu)的破乳方法。

表3 不同破乳方法的平均回收率Table 3 The average recovery yields of different eliminating emulsification methods

圖3 不同破乳方法對PAEs標準品平均響應(yīng)值的影響Fig.3 Effects of different eliminating emulsification methods on average response values of PAEs at 50 μg/L

2.3.2 超聲處理時間的優(yōu)化

針對啤酒樣品中溶有大量CO2、成分復(fù)雜等特點，先對樣品分別進行 0、5、10、20、30 min 的超聲處理，然后進行萃取和GC-MS測定。以響應(yīng)值為指標，對不同處理時間的結(jié)果進行顯著性分析(以DBP為例)，結(jié)果見表4;以回收率為指標，考察不同處理時間對結(jié)果可靠性和重現(xiàn)性的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲處理時間的優(yōu)化Fig.4 Optimization of the ultrasonisation time

從響應(yīng)值顯著性分析可看出:超聲處理對檢測結(jié)果有顯著影響，說明了超聲處理的必要性。超聲0 min 與超聲5、10、20、30 min 具有顯著性差異，而超聲5、10、20 min之間無顯著性差異，選擇5 min作為最優(yōu)超聲處理時間。

表4 超聲處理對響應(yīng)值影響的顯著性分析(以DBP為例)Table 4 The significance analysis for the effect of ultrasonic treatment on the response value(for DBP)

從平均回收率分析，不進行超聲處理(即0 min)的回收率明顯低于超聲處理的結(jié)果，而超聲處理5、10、20、30 min的回收率分別為 89.70%、87.14%、94.45%、103.13%，即均在87%～103.2%之間。這可能是因為超聲處理可以除去啤酒樣品中溶解的CO2，減少了氣體的干擾;同時可以促進乙醇的揮發(fā)，減少乙醇對PAEs的溶解，提高了萃取率;還可以除去一些不穩(wěn)定成分，降低在后續(xù)萃取過程中乳化程度以及對PAEs測定結(jié)果的影響。綜上分析，超聲時間在0～30 min范圍內(nèi)，隨超聲時間的增加，響應(yīng)值增強，超聲處理5 min以上，可保證其回收率為87% ～103.2%，即隨著超聲時間的增加，響應(yīng)值、回收率總體呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢，因此，為節(jié)約時間，選用5 min作為超聲處理時間。

2.4 分析方法的回收率和精密度驗證

為了驗證方法的準確度，采用最優(yōu)的實驗方法，對啤酒樣品進行25、50、125 μg/L三個不同水平的加標回收實驗，每一水平分別做6個平行，計算平均回收率和相對標準偏差?？瞻讓嶒灣患訕藴蕵悠吠猓溆鄿y定步驟均相同。采用外標法定量，結(jié)果如表5所示。

表5 不同加標濃度的加標回收率及RSDs(n=6)Table 5 Recoveries and relative standard deviations of different standard concentration(n=6)

結(jié)果表明，樣品中 PAEs加標的回收率在88.21%～110.11%，RSD在0.40%～5.49%(均小于10%)，表明該方法回收率好，精密度高。

2.5 市售啤酒樣品的檢測

將上述建立的方法應(yīng)用于市售啤酒中PAEs含量測定，共測定 20種啤酒樣品，其中共檢出DMP、DBP、DEP、DIBP、DEHP 這 5 種 PAEs，其分布情況如表6所示。

表6 啤酒中PAEs類物質(zhì)檢測結(jié)果 單位:μg/LTable 6 Determination results of phthalates in beer

從表6可以看出，市售啤酒中 DMP、DBP、DEP、DIBP、DEHP的檢出率分別為10%、5%、20%、95%、55%，但檢出的PAEs含量并不高，質(zhì)量濃度在0.77～12.18 μg/L。其中 DEHP 含量為 7.37 ±0.61 μg/L，略高于美國環(huán)保局規(guī)定的飲水中DEHP的最大允許濃度6 μg/L，但低于歐洲食品安全局規(guī)定的每日允許攝入量的最大劑量0.05 mg/kg(體重)的標準。

3 結(jié)論

本研究建立了利用GC-MS同時測定啤酒中12種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的方法，與我國頒布的食品中PAEs的檢測標準方法相比較，本方法創(chuàng)新點如下:(1)針對啤酒樣品采取超聲處理，不僅可以除去啤酒中溶解的CO2，還可消除樣品中不穩(wěn)定成分對測定的干擾，從而避免了復(fù)雜成分引起的誤差，提高了萃取效率及檢測準確度;(2)萃取過程中加入NaCl并超聲處理的方法有效解決了乳化難題，分層效果更好，萃取效率大幅度提高。精密度和回收率實驗結(jié)果表明加入NaCl與超聲萃取并用方法的可行性。通過加標回收率的驗證和對市售啤酒樣品的檢測，證明了該方法具有靈敏度高、簡便快速、重現(xiàn)性好的優(yōu)點。

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