汪偉偉，夏 歆，王靜瑜，張桂紅，陳 龍，黃新祥，生秀梅

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

傷寒沙門菌外膜孔道蛋白o(hù)mpC、ompF缺陷株的制備及其耐藥性

汪偉偉，夏 歆，王靜瑜，張桂紅，陳 龍，黃新祥，生秀梅

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：制備傷寒沙門菌ompC缺陷株及ompC-ompF雙缺陷株，研究外膜孔道蛋白OmpC、OmpF在傷寒沙門菌耐藥中的作用。方法：經(jīng)自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法制備ompC缺陷株及ompC-ompF雙缺陷株，比較傷寒沙門菌ompC缺陷株、ompF缺陷株及ompC-ompF雙缺陷株與野生株在多黏菌素B、卡那霉素以及氨芐青霉素處理下的生存能力。結(jié)果：成功制備傷寒沙門菌ompC單缺陷以及ompC-ompF雙缺陷株。各菌株在普通培養(yǎng)條件下生長情況無差異；多黏菌素B及氨青芐霉素處理條件下ompC缺陷株、ompC-ompF雙缺陷株生存能力明顯強(qiáng)于野生株，而ompF缺陷株生存能力則低于野生株；卡那霉素處理條件下，各缺陷株生存能力均明顯低于野生株。結(jié)論：外膜孔道蛋白OmpC、OmpF參與傷寒沙門菌耐藥，但對不同藥物的耐藥機(jī)制不盡相同，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

傷寒沙門菌；OmpC；OmpF；抗生素；耐藥性

傷寒沙門菌（Saimoneiia enterica serovar Typhi，S.Typhi）是一種對人類腸道致病的革蘭陰性桿菌，感染人體后常引起全身系統(tǒng)性感染傷寒熱（typhoid fever）［1-3］。革蘭陰性菌的外膜是限制β-內(nèi)酰胺類抗生素進(jìn)入菌體的第一道屏障?？咕幬镞M(jìn)入外膜有特異性和非特異性兩種通道［4］。大腸埃希菌K-12中外膜親水性的非特異性孔道蛋白（porin）為三聚體結(jié)構(gòu)，兩個孔道蛋白為OmpF與OmpC。OmpF的孔徑為1.2 nm，OmpC的孔徑為1.1 nm［4-6］。營養(yǎng)物質(zhì)和β-內(nèi)酰胺類抗生素大多經(jīng)過此通道擴(kuò)散進(jìn)入大腸埃希菌體內(nèi)［4］。

有關(guān)OmpF與OmpC參與傷寒沙門菌耐藥的研究尚未有報道。本研究擬構(gòu)建ompC缺陷株（ΔompC）及ompC-ompF雙缺陷株（ΔompC-ompF），比較傷寒沙門菌ompC缺陷株、ompF缺陷株及ompC-ompF雙缺陷株與野生株在多黏菌素B、卡那霉素以及氨芐青霉素處理下的生存能力，旨在探討外膜孔道蛋白OmpC、OmpF在傷寒沙門菌耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

傷寒沙門菌野生株S.Typhi GIFU10007以及ΔompF、E.coii λ372和自殺質(zhì)粒pGMB151來自日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室；大腸埃希菌DH5α由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、T4DNA連接酶、堿性磷酸酶、Ex Taq、Ex Taq緩沖液、dNTP、DL2000標(biāo)準(zhǔn)參照物均為TaKaRa（大連）公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒，氨芐青霉素，卡那霉素（Sigma公司）；胰蛋白胨和酵母提取物（OXOID公司）；PB購自上海谷研實業(yè)有限公司；DNA聚合酶pfu（Fermentas公司）；酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）混合液（So1arbio公司）；質(zhì)粒小量提取試劑盒（AXYGEN公司）。實驗所用引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成；NaC1、NaOH、KC1、Na2HPO4、KH2PO4、EDTA-2Na 2H2O、冰乙酸、無水乙醇、異丙醇皆為分析純級國產(chǎn)試劑。

1.3 主要儀器

核酸紫外檢測儀（Eppendorf Biophotometer）；PCR儀（Mastercyc1er Persona1，Eppendorf公司，德國）；凝膠成像系統(tǒng)（Gene公司、美國）；電轉(zhuǎn)化儀（BioRad公司GENE PULSERⅡ）；高速冷凍離心機(jī)Megafuge（HERAEUS）；空氣浴搖床TH-15（Johanna Otto公司，德國）。

1.4 方法

1.4.1 引物設(shè)計及合成 根據(jù)NCBI公布的傷寒沙門菌Ty2基因序列信息，以S.Typhi GIFU10007 DNA為模板，用O1igo 6.0軟件在ompC基因上游和下游設(shè)計兩對特異性PCR引物：P1A/P1B和P2A/ P2B，序列如下，P1A：CGGGATCCCGGTTGAAATAGGGGTAAACAGACA；P1B：CGATGTCCTGGTCTAATTTGTTGCCGTCTT；P2A：CAAATTAGACCAGGACATCGTAAAATACGT；P2B：CGGGATCCGTCATTTTCATCGCTGTTTATCCTC。P1A和P2B含Bam HⅠ酶切位點，在P1A及P2B的5′端加接，下劃線部分為Bam HⅠ酶切位點。設(shè)計的上游同源片段F1長501 bp，下游同源片段F2長293 bp。上下游片段之間870 bp堿基為缺失部分。利用高保真DNA聚合酶pfu對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4.2 目的基因的獲取及陽性克隆的篩選 以S. Typhi GIFU10007的全基因組為模板，PCR擴(kuò)增目的基因上、下游同源性片段F1、F2。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖（10 g/L）凝膠電泳，EB染色，Genius凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析鑒定。以同源性片段F1、F2稀釋10倍的混合液為模板，以P1A/P2B為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。大批量擴(kuò)增后采用Promega公司的膠回收試劑盒回收?；厥掌闻cpGMB151自殺質(zhì)粒用BamHⅠ酶切處理，用酚仿-乙醇法純化后T4連接酶16℃連接4 h，將連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化入E. coii SPY372λpir感受態(tài)細(xì)胞。次日挑取48個單菌落增菌后分別刮取菌苔于含40 μL蒸餾水的EP管中，用酚仿抽提法提取基因組進(jìn)行電泳，初步篩選含陽性質(zhì)粒的細(xì)菌。將陽性質(zhì)粒送上海生工測序以進(jìn)一步驗證。

1.4.3 陽性自殺質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化傷寒沙門菌野生株及ΔompF 分別將2 mL LB過夜振搖的野生株和ΔompF以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到20 mL LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，制備相應(yīng)電擊感受態(tài)細(xì)胞。分別取2 μg重組陽性自殺載體與40 μL的電擊感受態(tài)細(xì)胞混合后，加到預(yù)冷的電極杯中進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。電擊后立即轉(zhuǎn)到37℃預(yù)溫的SOC營養(yǎng)液中，37℃振搖1 h，然后涂布于含氨芐西林的LB平板37℃過夜。

1.4.4 同源重組菌株的篩選鑒定 分別挑取一株在氨芐西林平板生長的抗性單菌落接種于1 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃250 r/min振搖6 h，用滅菌水稀釋105倍后取100 μL涂布于含5％蔗糖的LB平板上37℃過夜培養(yǎng)，篩選耐蔗糖菌落，用PCR（引物P1A、P2B）觀察傷寒沙門菌的重組變異。連續(xù)3次傳代8個單菌落驗證均為重組菌，則為穩(wěn)定變異株。

1.4.5 生長曲線的測定

接種野生株、ΔompC和ΔompF及ΔompC-ompF單菌落到2 mL LB，過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到20 mL LB中，250 r/min，每小時檢測菌液600 nm光密度（D）值。重復(fù)3次，取平均值，比較各菌株在普通LB下的生長情況。以同樣方法檢測4種菌株分別在含0.2 μg/mL多黏菌素B、2.0 μg/mL氨芐青霉素或7.5 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)條件下的生長情況。

2 結(jié)果

2.1 成功制備傷寒沙門菌ompC缺陷株及ompC-ompF雙缺陷株

2.1.1 重組質(zhì)粒pGMB151的構(gòu)建及酶切鑒定 以傷寒沙門菌GIFU10007野生株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得ompC基因上、下游同源性核苷酸片段F1和F2（圖1a）。上下游片段利用黏性末端自連的特性連接成F1-F2片段后，克隆至自殺質(zhì)粒pGMB151并轉(zhuǎn)化入E.coii SPY372λpir。利用其氨芐西林抗性及空載體與重組載體分子質(zhì)量大小差異，初篩出陽性菌落，提取陽性質(zhì)粒進(jìn)行PCR及Bam HⅠ酶切鑒定，結(jié)果表明重組自殺質(zhì)粒pGMB151構(gòu)建成功（圖1b）。

（a）1：ompC上游擴(kuò)增片段（501 bp）；2：ompC下游擴(kuò)增片段（293 bp）；M：DL2000標(biāo)準(zhǔn)參照物（b）1：重組自殺質(zhì)粒；2：重組自殺質(zhì)粒Bam HⅠ酶切；M：DL2000標(biāo)準(zhǔn)參照物圖1 重組pGMB151質(zhì)粒的制備及鑒定

2.1.2 ompC缺陷株的篩選鑒定 將含ompC同源性核苷酸片段的重組自殺質(zhì)粒pGMB151通過電穿孔法導(dǎo)入到傷寒沙門菌GIFU10007野生株中。首先在氨芐西林平板上篩選抗性菌落，抗性菌落接種于含5％蔗糖的LB平板上37℃溫箱過夜培養(yǎng)，篩選耐蔗糖菌落。首次經(jīng)LB-蔗糖平板篩選的菌落用PCR觀察結(jié)果，大部分細(xì)菌出現(xiàn)大小2個片段，即共價整合體，挑選其中小片段占優(yōu)勢的菌落繼續(xù)篩選得到完全重組菌株后，在LB平板上連續(xù)傳代4次，篩選結(jié)果均僅有小片段出現(xiàn)（圖2），顯示已完全重組，說明該菌株已成為穩(wěn)定的變異株。

圖2 ompC基因缺陷株的篩選

2.1.3 ompC-ompF雙缺陷株的篩選鑒定將含ompC同源性核苷酸片段的重組自殺質(zhì)粒pGMB151通過電穿孔法導(dǎo)入到傷寒沙門菌GIFU10007的ompF缺陷株中。在氨芐西林平板上篩選抗性菌落，抗性菌落接種于含5％蔗糖的LB平板上37℃溫箱過夜培養(yǎng)，篩選耐蔗糖菌落。挑選其中小片段占優(yōu)勢的菌落繼續(xù)篩選得到完全重組菌株后，在LB平板上連續(xù)傳代4次，篩選結(jié)果均僅有小片段出現(xiàn)（圖3），說明ompC-ompF雙缺陷株制備成功，該菌株已成為穩(wěn)定的變異株。

M：DL2000標(biāo)準(zhǔn)參照物；1-4：ompC-ompF雙缺陷株ompC基因PCR驗證；5：GIFU10007野生株ompC基因PCR驗證；6-9：ompC-ompF雙缺陷株ompF基因PCR驗證；10：GIFU10007野生株ompF基因PCR驗證圖3 ompC-ompF基因雙缺陷株的篩選

2.2 不同藥物處理條件下各菌株的生存能力

為探索OmpC及OmpF在傷寒沙門菌耐藥中的作用，本研究比較了普通培養(yǎng)條件及多黏菌素B、氨芐西林、卡那霉素處理條件下，傷寒沙門菌野生株、ΔompC、ΔompF及ΔompC-ompF的生存能力。結(jié)果見圖4。在無藥物處理的普通LB培養(yǎng)條件下，各缺陷株與野生株的生存能力基本一致，說明在非藥物處理條件下OmpC、OmpF對傷寒沙門菌的生存能力無明顯影響。多黏菌素B及氨芐西林處理條件下，ΔompC及ΔompC-ompF生存能力明顯強(qiáng)于野生株，而ΔompF則低于野生株。卡那霉素處理條件下，ΔompC、ΔompF及ΔompC-ompF的生存能力均明顯低于野生株，說明傷寒沙門菌OmpC和OmpF孔道均參與外排進(jìn)入菌體內(nèi)的卡那霉素。

圖4 不同藥物處理條件下各菌株的生存能力

3 討論

膜孔道蛋白使某些藥物不能進(jìn)入菌體內(nèi)部，產(chǎn)生“固有性耐藥”（intrinsic resistance）。這種耐藥并不是由于染色體的突變或獲得耐藥質(zhì)粒所致［4］。目前，關(guān)于孔道蛋白的報道主要集中在大腸埃希菌，大腸埃希菌外膜蛋白OmpC、OmpF主要構(gòu)成細(xì)胞膜孔道蛋白，使小分子物質(zhì)（相對分子質(zhì)量小于600）滲入細(xì)菌體內(nèi)［7］?？椎赖鞍譕mpC和OmpF的表達(dá)受生長環(huán)境因素如溫度、滲透壓和pH值等的影響，OmpF的孔道直徑（1.2 nm）大于OmpC的孔道直徑（1.1 nm），所以O(shè)mpF在低滲條件下表達(dá)，OmpC的孔徑較小因而在高鹽環(huán)境中表達(dá)，用來調(diào)節(jié)細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓［8］。在宿主腸道高滲環(huán)境中大腸埃希菌的孔道蛋白以O(shè)mpC表達(dá)為主，以降低膽鹽的滲入［9-10］。

本研究結(jié)果說明，藥物刺激時，傷寒沙門菌會通過改變OmpF和OmpC的表達(dá)，以改變膜的通透性從而參與抵制抗生素的殺傷作用。ΔompC中ompC的缺失可能導(dǎo)致OmpC孔道的關(guān)閉，以阻止多黏菌素B及氨芐西林進(jìn)入菌體內(nèi)而提高細(xì)菌生存能力；OmpF孔道則可能是多黏菌素B及氨芐西林的排出通道，其缺失不利于已進(jìn)入菌體內(nèi)藥物的外排從而使細(xì)菌生存能力下降。大腸埃希菌中OmpR-EnvZ雙組分系統(tǒng)、DNA連接蛋白HNS、宿主調(diào)節(jié)蛋白IHF以及CAMP均可影響OmpF，OmpC的表達(dá)［10］。另外，micF是ompF基因mRNA的反義RNA，它可與mRNA互補結(jié)合，也可導(dǎo)致OmpF合成減少，但在菌體固有質(zhì)粒中ompF基因表達(dá)又可恢復(fù)正常［11-12］。不同藥物處理時，各菌株的生存能力存在一定差異，說明OmpC和OmpF參與傷寒沙門菌抵制不同藥物殺傷作用的機(jī)制并不完全相同，仍需進(jìn)一步研究。

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Construction of ompC and ompF deletion mutant in Salmonella enterica serovar Typhi and their participation in drug-resisitance

WANG Wei-wei，XIA Xin，WANG Jing-yu，ZHANG Gui-hong，CHEN Long，HUANG Xin-xiang，SHENG Xiu-mei
（Schoo1 of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To construct ompC de1etion mutant and ompC-ompF doub1e de1etion mutant，and investigate the ro1e of outer membrane protein OmpC and OmpF in drug-resistance of S.Typhi.Methods：The ompC de1etion mutant and the ompC-ompF doub1e de1etion mutant of S.Typhi were prepared by the method of homo1ogous recombination mediated by suicide p1asmid.The growth abi1ity of the wi1d type，ompC de1etion mutant，ompF de1etion mutant，and ompC-ompF doub1e de1etion mutant under po1ymyxin B，Kanamycin and Ampici11in treatment were performed.Results：The ompC de1etion mutant and the ompC-ompF doub1e de1etion mutant of S.Typhi were successfu11y constructed.The resu1ts showed that no significant difference was observed between these strains under common conditions.However，under po1ymyxin B and Ampici11in treatment，the growth of ompC de1etion mutant and ompC-ompF doub1e de1etion mutant were much higher than that of the wi1d type strain，whi1e the growth of ompF de1etion mutant was s1ower than that of the wi1d type strain.Under Kanamycin treatment，the growth of a11 the mutants was significant1y s1ower than that of the wi1d type strain.Conclusion：OmpC and OmpF are invo1ved in the drug-resistance of S. Typhi，and the mechanisms are different between different kinds of drugs，which need further research.

Saimoneiia enterica serovar Typhi；OmpC；OmpF；antibiotics；drug resistance

R378.22

A

1671-7783（2015）06-0532-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150152

2015-07-06 ［編輯］ 何承志

國家自然科學(xué)基金資助項目（31000046）；江蘇大學(xué)高級人才啟動基金資助項目（11JD063）；國家博士后基金資助項目（2015M571702）

汪偉偉（1989—），女，碩士研究生；生秀梅（通訊作者），副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mai1：shengxiumei@ujs.edu.cn