梁 敏，何麗娜，董新榮，崔夫知

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南長沙410128）

大孔樹脂分離純化葡萄籽原花青素的研究

梁 敏，何麗娜，董新榮*，崔夫知

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南長沙410128）

本文研究了大孔樹脂分離純化葡萄籽提取物中原花青素的方法。先對5種大孔吸附樹脂用靜態(tài)篩選方法選擇HPD100和HPD400樹脂，進(jìn)一步以動態(tài)吸附與解吸附實驗比較了兩種樹脂對葡萄籽提取物原花青素的吸附與洗脫效果。結(jié)果表明：HPD100、HPD400樹脂對葡萄籽提取物中原花青素的動態(tài)飽和吸附量分別為101.2和92.1mg·g-1，乙醇洗脫的總洗脫率分別為96.5%和92.0%；其中30%乙醇洗脫樣品中原花青素含量分別為74.8%和85.0%；50%乙醇洗脫樣品中原花青素含量分別為70.0%和73.9%。與HPD100相比較，HPD400更適合葡萄籽原花青素的分離與富集。

葡萄籽；原花青素；大孔樹脂；分離

原花青素（Procyanidins，PC）是一類自然界廣泛存在的植物多酚類物質(zhì)，具有良好的抗氧化作用，其清除自由基的能力是VC的50倍，VE的20倍[1]。此外，還具有抗突變、抗心血管疾病、抗癌、延緩衰老等活性[2-4]，因而引起了極大的關(guān)注。

葡萄籽是原花青素的重要來源。我國是葡萄生產(chǎn)大國，大量葡萄用來釀酒，產(chǎn)生的大量籽具有綜合利用的價值。葡萄籽提取物需要分離純化以提高原花青素的含量，其分離方法很多，其中大孔樹脂吸附法由于操作簡單、以再生利用、產(chǎn)品純度高等特點受到人們的廣泛關(guān)注。曹明華[5]以O(shè)3F3大孔吸附樹脂作為吸附劑，葡萄籽提取物以水溶解后上樣，吸附樹脂再以40%的乙醇溶液脫，葡萄籽中原花青素的純度可達(dá)到85.8%，回收率可達(dá)到86.6%。范明霞[6]等比較了7種大孔樹脂對原花青素的吸附解吸性能，結(jié)果表明，AB-8大孔樹脂對葡萄籽中原花青素的吸附效果最好，原花青素洗脫率為94.37%，所得溶質(zhì)純度可達(dá)89.63%。

葡萄因品種、產(chǎn)地等差異，葡萄籽中原花青素含量、雜質(zhì)種類往往不同，導(dǎo)致葡萄籽提取物的原花青素的含量也不一樣，其純化的技術(shù)一般需要根據(jù)具體情況進(jìn)行。本文以國內(nèi)某葡萄酒廠提供的葡萄籽為原料，對HPD系列大孔樹脂富集其提取物中的原花青素進(jìn)行了探討，以期為該品種葡萄籽中原花青素的利用提供依據(jù)。

1 實驗部分

稱取1g裝入錐形瓶，再量取100mL上樣溶液于各錐形瓶中，置于20℃的水浴恒溫振搖器中振搖，每隔1h準(zhǔn)確移取上清液1 mL，顯色后測定其吸光度。

靜態(tài)洗脫：將吸附飽和的樹脂過濾，用蒸餾水潤洗，去除雜質(zhì)后濾干。分別加入20mL 95%乙醇，置于20℃的水浴恒溫振搖器中振搖，每隔1h準(zhǔn)確移取上清液1mL，顯色后測定其吸光度。

重復(fù)篩選：選取出對原花青素吸附效果、解吸效果都較好的3種樹脂，按靜態(tài)吸附方法進(jìn)行靜態(tài)飽和吸附；靜態(tài)洗脫時則以乙醇濃度30%、50%、70%、95%各20mL進(jìn)行梯度洗脫，比較乙醇濃度對吸附在大孔樹脂上的原花青素的洗脫效果。

1.2.4 大孔樹脂的動態(tài)吸附與洗脫動態(tài)吸附：將靜態(tài)篩選選取出來的樹脂預(yù)處理后濕法裝柱（樹脂體積大約為23mL，自然晾干后濕重約為16g）。將葡萄籽的提取原液（顯色后測定其吸光度）緩慢從柱頂加入，調(diào)節(jié)流速為10mL/30min，每10mL接受一份流出液，顯色后測定其吸光度，直至樹脂吸附飽和，繪制原花青素的動態(tài)吸附曲線。

動態(tài)梯度洗脫：用4倍柱床體積（80mL）的蒸餾水清洗樹脂床后，再分別用10%、30%、50%、70%、95%乙醇、丙酮各80mL對樹脂床進(jìn)行梯度洗脫，調(diào)節(jié)流速為10mL/30min，每10mL接受一份流出液，取適量流出液稀釋相應(yīng)倍數(shù)，顯色后測定其吸光度，繪制原花青素在不同濃度乙醇下的動態(tài)洗脫曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按2.2.1方法將原花青素對照樣品溶液經(jīng)顯色后，用紫外分光光度計在200～800nm范圍內(nèi)掃描得到原花青素顯色后的最大吸收波長，其UV光譜圖見圖1。

1.1 材料與儀器

葡萄籽（國內(nèi)某葡萄酒廠）；葡萄籽原花青素對照樣品（含量≥95%）（湖南三福公司）；HPD100，HPD300，HPD400，HPD600，HPD750型大孔樹脂（河北寶恩公司）；香蘭素（中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司分析純試劑）；其余均為分析純試劑；水為二次蒸餾水。

AX-200型萬分之一電子天平（日本Shimadzu Philippines公司）；80-2型離心沉淀器（上海手術(shù)器械廠）；SHZ-B多功能水浴恒溫振搖器（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；UNICO 2000可見分光光度計（尤尼柯（上海）有限公司）；SB25-12DT超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線與含量測定

對照樣品溶液配制：準(zhǔn)確稱取原花青素對照樣品0.0032g置于小燒杯中，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，加甲醇定容搖勻，配制成原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

顯色溶劑配制：顯色溶劑由A和B混合配成，A為1%的香草醛溶液，B為8%的濃HCl，A∶B=1∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用。準(zhǔn)確稱取0.5010g香草醛置于小燒杯中，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加甲醇定容搖勻；用量筒量取的4.0 mL濃鹽酸置于小燒杯中，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加甲醇定容搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別準(zhǔn)確移取1.5、2.5、3.5、4.5、5.5mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，加甲醇定容搖勻。分別從10mL容量瓶中準(zhǔn)確移取原花青素溶液1mL（另取1mL甲醇為空白）于比色管中，精密加入5mL顯色劑，搖勻避光，在30±1℃恒溫水浴下加熱顯色30min，取出比色管后冷卻10min，用1cm比色皿在最大吸收波長處測定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：樣品通過甲醇溶解，稀釋，定容后，通過HCl-香草醛法在原花青素的最大吸收波長處測量其吸光度。

1.2.2 原花青素的提取與上樣液的制備稱取脫脂葡萄籽30g，以50%的乙醇、料液比1∶20、提取溫度90℃的條件下回流4h。冷卻后，過濾，收集濾液，減壓去除乙醇。稀釋一定倍數(shù)后用80-2型離心沉淀器離心，直至溶液澄清透明，將其稀釋至600mL，按1.2.1中方法顯色后測定其吸光度。

1.2.3 大孔樹脂的靜態(tài)篩選

靜態(tài)吸附：選擇5種不同型號大孔樹脂，準(zhǔn)確

圖1 原花青素顯色后的紫外光譜圖Fig.1UV spectrogram of anthocyanin

從圖1可以看出，原花青素顯色后在494nm處有最大吸收峰。故選用494nm為原花青素含量測定的波長。

以不同濃度的對照品溶液在494nm處依次測量吸光值，以原花青素濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2Standard curve of anthocyanin

原花青素濃度在0.19～0.77mg·mL-1范圍內(nèi)，濃度與吸光度成線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-0. 02855+1.16277χ（R2=0.999,n=5），y為波長494nm處的吸光度，χ為原花青素溶液的濃度（mg·mL-）1。

2.2 大孔樹脂的靜態(tài)篩選

2.2 .1 靜態(tài)飽和吸附曲線本文考察了5種大孔吸附樹脂對葡萄籽原花青素的靜態(tài)吸附性能。通過測定樣品溶液經(jīng)大孔樹脂靜態(tài)吸附一定時間后上清液吸光度的變化，判斷大孔樹脂對原花青素的吸附情況，結(jié)果見圖3。

圖3 大孔樹脂對原花青素的靜態(tài)吸附曲線Fig.3Static adsorption curve of anthocyanin on macroporous resin

由圖3可知，在2h內(nèi)上清液的吸光度迅速減小，即5種樹脂在此段時間內(nèi)對樣品溶液中的原花青素吸附速度較快。其中，HPD100、HPD400、HPD600號在4h的時候基本達(dá)到吸附飽和，其中HPD400吸附量最大，HPD600吸附量最??；HPD300號樹脂在5h后基本吸附飽和，吸附容量為該系列樹脂中最大；HPD750在吸附6h達(dá)飽和，吸附時間長而且吸附量較小。綜合比較吸附容量，HPD100、HPD300、HPD400大孔樹脂對原花青素的吸附效果較好。

2.2.2 靜態(tài)洗脫為了考察吸附在大孔樹脂上的原花青素的解吸效果，本文將吸附飽和的樹脂過濾，經(jīng)水洗后再以95%的乙醇進(jìn)行洗脫，并考察解吸附1h時的解吸液的吸光度（稀釋兩倍后），結(jié)果見表1。

表1 靜態(tài)洗脫結(jié)果Tab.1Results of static desorption

靜態(tài)洗脫實驗中，解吸液的吸光度越大表明洗脫效果越好，洗脫率高。由表1可知，除HPD600樹脂外，其余4種樹脂在洗脫1h時的吸光值均較大，說明它們洗脫效果較好。綜合吸附能力和洗脫效果，選擇HPD100、HPD300、HPD400 3種樹脂進(jìn)行重復(fù)篩選。

2.2.3 重復(fù)篩選為了進(jìn)一步比較HPD100、HPD 300、HPD400 3種大孔樹脂對葡萄籽提取物中原花青素的吸附和洗脫效果，對上述3種大孔樹脂進(jìn)行重復(fù)篩選。結(jié)果HPD300、HPD400號兩種樹脂的吸附量較HPD100的吸附量稍大，與初選結(jié)果基本一致。

在靜態(tài)洗脫時，進(jìn)一步考察了乙醇濃度對吸附在樹脂上的原花青素的梯度洗脫效果。吸附了原花青素的樹脂分別以不同濃度的乙醇依次洗脫，并分別測定其洗脫液的吸光度，結(jié)果見表2。由表2可知，吸附在上述3種樹脂上的原花青素主要都由30%乙醇解吸附。由于HPD100號的吸附量比HPD300、HPD400的稍小，因此，HPD100號樹脂的洗脫效果相對比較會更好一些。由于HPD100和HPD300樹脂均為非極性樹脂，HPD400號為中極性樹脂，綜合考慮選取HPD100和HPD400大孔樹脂進(jìn)行下一步的動態(tài)吸附和洗脫。

表2 HPD100、HPD300、HPD400號樹脂靜態(tài)梯度洗脫結(jié)果Tab.2Results of static desorption on macroporous resin 2,3 and 6

2.3 大孔樹脂的動態(tài)吸附和洗脫

2.3.1 樹脂的動態(tài)飽和吸附曲線將等體積的經(jīng)處理的HPD100和HPD400樹脂分別置于玻璃柱中，分別將已知吸光度的樣品溶液加入樹脂柱頂，以同樣的速度流經(jīng)樹脂床，每10mL接受一份流出液，測定其吸光度，直至樹脂吸附飽和。繪制動態(tài)飽和吸附曲線見圖4。

圖4 樹脂動態(tài)吸附曲線Fig.4Dynamic adsorption curve

由圖4可知，隨著上樣量的增大，流出液中的吸光值逐漸增加，即樹脂對原花青素的吸附量減小。當(dāng)HPD400號樹脂的上樣體積超過1000mL時，流出液的吸光值增加很快，即它對樣品溶液中的原花青素的吸附量迅速降低；當(dāng)上樣體積達(dá)到3400mL，流出液的吸光值基本與上樣液一致，即HPD400樹脂吸附葡萄籽原花青素基本達(dá)到飽和。通過計算，HPD400樹脂對原花青素的動態(tài)飽和吸附量達(dá)到92.1mg·g-1。對于HPD100號樹脂而言，當(dāng)上樣體積達(dá)到1100mL時，HPD100樹脂對原花青素的吸附量迅速降低；當(dāng)上樣體積達(dá)到3500mL，流出液中原花青素的含量與上樣液中含量基本相同，此時HPD100樹脂吸附葡萄籽原花青素基本達(dá)到飽和。通過計算，HPD100樹脂對原花青素的動態(tài)飽和吸附量達(dá)到101.2mg·g-1。

2.3.2 樹脂的動態(tài)梯度洗脫將吸附飽和的樹脂以4BV的不同濃度乙醇（10%、30%、50%、70%、95%）和丙酮梯度洗脫，每10mL（0.5BV）收集，取洗脫液進(jìn)行比色測定原花青素含量，結(jié)果見圖5。

圖5 乙醇梯度洗脫曲線（乙醇濃度：A，10%；B，30%；C，50%；D，70%）Fig.5Elution curve（ethanol concentration：A,10%;B,30%;C,50%;D,70%）

從圖5可以看出，兩種樹脂的乙醇梯度曲線相似。原花青素主要均由30%、50%乙醇洗脫液。但HPD100號樹脂的洗脫濃度略高于HPD400號樹脂。由于95%乙醇洗脫液和丙酮洗脫液中原花青素的含量很低，故未進(jìn)行討論。

進(jìn)一步將兩種樹脂10%、30%、50%、70%的洗脫液分別合并，減壓濃縮至干，得到固體粉狀物，測定樣品中原花青素的含量，結(jié)果表明HPD100、HPD400兩種樹脂的10%乙醇洗脫物質(zhì)量少（分別為總洗脫物的12.3%、13.5%）、原花青素含量也很低（分別為9,2%和9.5%）；70%乙醇洗脫物非常少。

吸附在HPD400、HPD100樹脂上的原花青素主要由30%和50%乙醇洗脫下來。分離前樣品（提取物）中原花青素的含量為36.3%。HPD100樹脂30%、50%乙醇洗脫樣品分別占總量的52.9%和32.9%，原花青素含量為74.8%和70.0%；乙醇梯度洗脫的總洗脫率為96.5%。HPD400樹脂30%、50%乙醇洗脫樣品分別占總量的47.7%和35.6%，原花青素含量為85.0%和73.9%；乙醇梯度洗脫的總洗脫率達(dá)到92.0%。

3 結(jié)論

我國葡萄產(chǎn)量大，除部分用于水果消費外，大量的葡萄用于釀酒，產(chǎn)生大量的葡萄籽。葡萄籽是一種可利用的資源，其中原花青素含量較高，具有重要的生物活性，受到廣泛關(guān)注。本文對某酒廠的葡萄籽原花青素經(jīng)乙醇提取后，采取大孔樹脂的分離純化。

本文比較了兩種極性不同的大孔樹脂HPD100和HPD400對葡萄籽原花青素的分離效果。結(jié)果HPD100、HPD400樹脂對葡萄籽提取物中原花青素的動態(tài)飽和吸附量分別為101.2和92.1mg·g-1，乙醇洗脫的總洗脫率分別為96.5%和92.0%；其30%乙醇洗脫樣品中原花青素含量分別為74.8%和85.0%；50%乙醇洗脫樣品中原花青素含量分別為70.0%和 73.9%。與HPD100相比較，HPD400樹脂的洗脫率稍低，但對原花青素的吸附與洗脫的選擇性可能好一些。因此，HPD400更適合葡萄籽原花青素的分離與富集。

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Seperation and enrichment of anthocyanin from grape seed by macroporous resin column chromatography

LIANG Min，HE Li-na，DONG Xin-rong，CUI Fu-zhi
（College of Science,Hunan Agricultural University,Changsha 410128，China）

The method for seperation and purification of anthocyanin from grape seed by macroporous resin column chromatography were studied in this work.Firstly,five kinds of macroporous resin were screened by static screening technology.Then resin HPD 100 and resin HPD 400 were choosed out as adsorbent of dynamic seperation.The results indicated that adsorptive capacity of rensin HPD100 and HPD 400 are 101.2 and 92.1mg·g-1with the elution rate of 96.5%and 92.0%,respectively.The content of anthocyanin in samples eluted by 30%ethanol were 74.8%and 85.0%and the content of anthocyanin in samples eluted by 50%ethanol 70.0%and 73.9%. Compared with resin HPD 100,HPD 400 is more effective for seperation and enrichment of anthocyanin from grape seed.

grape seed;anthocyanin;macroporous resin;seperation

R284.2；O652.62

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20150365

2014-08-26

梁敏（1978-），女，內(nèi)蒙古人，大學(xué)本科，助理實驗師，從事化學(xué)實驗教學(xué)及管理工作、天然產(chǎn)物化學(xué)研究工作。

董新榮，男，博士，教授，主要從事有機(jī)化學(xué)與天然產(chǎn)物化學(xué)的教學(xué)與研究工作。