王平章，馬大龍

·綜述·

調(diào)節(jié)性T細胞免疫治療策略

王平章，馬大龍

調(diào)節(jié)性免疫細胞（regulatory immune cell）通常是指發(fā)揮免疫抑制作用的多種類型免疫細胞，其中目前公認最為重要的是FOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）［1］。鑒于FOXP3+Treg的發(fā)現(xiàn)及其在免疫系統(tǒng)中重要地位的確立，使得Treg的研究成為當(dāng)今最活躍的領(lǐng)域之一，并掀起了其在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的熱潮。根據(jù)發(fā)育來源，Treg可分為自然調(diào)節(jié)性Treg（natural Treg，nTreg）和誘導(dǎo)性或適應(yīng)性Treg（induced/adaptive Treg，iTreg/aTreg）；前者直接由胸腺細胞經(jīng)歷陰性和陽性選擇發(fā)育而來，后者在外周組織器官中由FOXP3-T細胞或CD45RA-FOXP3loT細胞在TGF-β等誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化而來?，F(xiàn)傾向于使用tTreg（thymus-derived Treg）和pTreg（peripherally-derivedTreg）稱呼這兩類調(diào)節(jié)性T細胞，而將iTreg僅用于描述體外誘導(dǎo)而來的FOXP3+Treg，以示與體內(nèi)FOXP3+Treg相區(qū)別［2］。

Treg作為維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的重要機制，其功能及數(shù)量的異常與腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥、移植排斥以及過敏性疾病等密切相關(guān)。圍繞Treg的免疫治療需要依據(jù)不同的病理類型分別對待并采取相應(yīng)的免疫治療策略。例如，打破機體的免疫抑制狀態(tài)有利于提高抗腫瘤和抗感染免疫，而對于移植排斥、自身免疫性疾病、過敏等則需要重新構(gòu)建機體對相關(guān)抗原的免疫耐受。本文就圍繞Treg為靶點、Treg的過繼轉(zhuǎn)移治療以及體內(nèi)誘導(dǎo)Treg三方面的免疫治療策略及存在問題作些介紹。

1 Treg為靶點的腫瘤免疫治療

近年來，腫瘤的免疫治療發(fā)展尤為迅猛。腫瘤的免疫治療包括腫瘤疫苗（如腫瘤抗原疫苗、腫瘤細胞疫苗、DC疫苗等），單克隆抗體（如anti-CD20、anti-HER-2/erbB2、anti-EGFR等），細胞因子（如IFN-α、IL-2等）以及免疫效應(yīng)細胞的過繼轉(zhuǎn)移療法等，多為直接增強機體的免疫應(yīng)答。Treg的發(fā)現(xiàn)為腫瘤免疫治療開啟了一個新的方向，即干擾機體的免疫抑制信號而間接增強機體抗腫瘤免疫能力。腫瘤組織中增高的Treg比例是腫瘤逃逸的機制之一。眾多小鼠腫瘤模型已清晰顯示出消除Treg可以增強抗腫瘤免疫，導(dǎo)致腫瘤消退；臨床中也發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、結(jié)直癌、食管癌、胃癌、肝癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌等患者外周血中出現(xiàn)更高頻率的Treg細胞；且一些腫瘤組織（如卵巢癌、非小細胞肺癌）中FOXP3+Treg的浸潤程度與預(yù)后不良呈正相關(guān)［3-4］。

針對Treg為靶點的抗腫瘤免疫主要包括抑制或清除體內(nèi)Treg、干擾Treg的抑制信號、干擾Treg向腫瘤組織遷移、阻礙Treg的發(fā)育等。針對Treg的靶向抑制劑包括單克隆抗體、化學(xué)小分子類藥物以及重組蛋白等。其中單克隆抗體由于其良好的機體耐受性及對靶分子作用的特異性而成為圍繞Treg為靶點藥物開發(fā)的主戰(zhàn)場。供單克隆抗體開發(fā)的Treg的主要靶點見表1。

表1 針對Treg的部分靶點及其單克隆抗體藥物開發(fā)

采用單克隆抗體干預(yù)抑制信號不只是針對Treg細胞表面的抑制性分子，還可以針對抗原遞呈細胞（APC）表面的配體。例如，PD-L1作為PD-1的主要配體在腫瘤細胞中表達上調(diào)以抑制機體的抗腫瘤免疫，目前針對PD-L1的單克隆抗體BMS936559在對黑色素瘤、非小細胞肺癌以及腎細胞癌等多種類型的腫瘤治療已完成I期臨床試驗［17］。有些單克隆抗體早在臨床中使用，但是Treg的發(fā)現(xiàn)使得對其藥理機制有了新的認識。例如，新的研究表明anti-CCR4（mogamulizumab）可選擇性清除ATL患者外周血CD4+FOXP3hiCD45RA-Treg從而增強抗腫瘤免疫［18］；動物模型中顯示，鼠源CTLA-4單克隆抗體的一些IgG亞型可以有效減少腫瘤浸潤的Treg數(shù)量，提高腫瘤內(nèi)Teff/Treg比例，但不誘導(dǎo)機體Treg或CTLA4+T細胞的清除［19-21］，這為針對CTLA-4的新的單克隆開發(fā)提供了新的思路。除單克隆抗體外，一些傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物紛紛被測試對Treg的影響。例如，地尼白介素-2（denileukin diftitox/DAB389-IL-2/Ontak，為白喉毒素的部分結(jié)構(gòu)與IL-2的融合蛋白）、低劑量的環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide）、舒尼替尼（sunitinib）、紫杉醇（paclitaxel）等可以降低Treg細胞數(shù)量［22-23］。此外，動物模型中顯示外源表達FOXP3的樹突狀細胞可以誘導(dǎo)針對FOXP3+細胞的細胞毒性T細胞，尤其是偏向于清除FOXP3+Treg［24］，由此提示發(fā)展FOXP3疫苗的可能性。

理論上，Treg特異性表達的標(biāo)志分子都可以成為藥物作用的靶點，但目前為止Treg仍缺乏特異性的標(biāo)志分子。文獻報道的Treg的標(biāo)志非常多，如CTLA-4、GITR、ICOS、CD69、CD62L、CD44、CD45變異體（CD45RA、CD45RO）、LAG-3、CD49b、CD39、CD103、HLA-DR、PD1、NRP1、CD27、CD45RBlo等，足有數(shù)十種［25-27］，但是這些分子的表達并不特異，其無法有效區(qū)分Treg與效應(yīng)細胞、記憶細胞或是活化的非調(diào)節(jié)性T細胞，在Treg細胞中的表達頻率也不盡相同［27］。由于Treg表達的基因并不特異，針對Treg的靶向策略實際上未必特異性地只針對Treg發(fā)生作用，如何有效提高針對Treg的靶向性是必須要面對的問題。由于一些已在臨床中使用的抗腫瘤藥物對Treg存在潛在的活化效果，不得不重新評估其作用或調(diào)整藥物使用方案。例如，IL-2在臨床中用于多種惡性腫瘤（如轉(zhuǎn)移性腎細胞癌及黑色素瘤等）的治療，但IL-2同樣可以促進Treg存活、增殖、發(fā)育以及維持Treg穩(wěn)態(tài)［28］。

Treg發(fā)揮抑制作用的機制眾多，如分泌抑制性的細胞因子IL-10、TGF-β及IL-35，直接殺傷靶細胞，通過對APC以及對靶細胞代謝途徑的調(diào)節(jié)而發(fā)揮抑制作用等［3，29-30］。多數(shù)機制在體外被試驗所證明，但在體內(nèi)尤其是在不同的腫瘤微環(huán)境中，究竟哪種機制占據(jù)關(guān)鍵地位或共同協(xié)同Treg最大程度地發(fā)揮抑制作用，仍有待研究。深入了解這些機制有利于提高抗腫瘤免疫的特異性，保證在抑制Treg作用的同時又不至于增加患自身免疫病的風(fēng)險。

2 Treg過繼轉(zhuǎn)移免疫治療

Treg過繼轉(zhuǎn)移免疫治療更多是應(yīng)用于移植排斥、自身免疫性疾病等需要建立對同種異體抗原、自身抗原耐受的情形（表2），以應(yīng)對持久化療所導(dǎo)致的嚴(yán)重毒副作用。移植排斥免疫治療的經(jīng)驗主要來自小鼠的骨髓、造血干細胞、皮膚、心臟、胰島、血管為主體的同種異體移植模型。小鼠骨髓移植的移植物抗宿主疾病（GVHD）模型首次揭示了過繼轉(zhuǎn)移的CD4+CD25+T細胞可以有效防止急性和慢性GVHD，而在已報道的4個Treg過繼轉(zhuǎn)移免疫治療的臨床試驗中有3個均為針對GVHD的治療［31-33］，另外1個是針對I型糖尿病的治療［34］。尚有一些針對骨髓或造血干細胞移植引起的GVHD、I型糖尿病、葡萄膜炎（uveitis）以及肝移植等Treg過繼治療方案正在進行之中［27］，例如，由多個國家不同研究中心共同開展的“One Study”計劃（http：//www.onestudy.org/）關(guān)注不同的具有調(diào)節(jié)作用的免疫細胞并在腎移植患者中測試其安全性和使用效果，最終達到提高腎移植患者的長期生存時間、減少藥物不良反應(yīng)發(fā)生率和降低患者的醫(yī)療費用支出的目的。

人外周血Treg的數(shù)量極少且只有CD4+CD25hiT細胞（約占外周血全部CD4+T細胞的1%～3%，不同個體有所差異）才具有免疫抑制活性（這點與小鼠CD4+CD25+Treg不同），因此建立對移植物的有效耐受、防治自身免疫性疾病等方面需要體外對Treg進行擴增，然后輸注到患者體內(nèi)［35］。Treg的體外擴增又可分為抗原特異性和非特異性擴增。

表2 已完成的Treg過繼轉(zhuǎn)移臨床試驗

在移植排斥治療中，同種異體抗原特異性的Treg比多克隆性Treg更為有效和安全，可以減少輸注的Treg數(shù)量，避免機體的免疫抑制狀態(tài)而增加感染和腫瘤的風(fēng)險。同種異體抗原特異性擴增依據(jù)Treg對抗原識別的途徑不同而采取自體抗原沖擊的DC、B細胞，異體淋巴細胞等刺激［35-36］。非特異性擴增一般采用anti-CD3、anti-CD28抗體，在高濃度IL-2存在時可使Treg得到數(shù)百乃至上萬倍的擴增［36］。

Treg過繼轉(zhuǎn)移在自身免疫性疾病中的治療效果更依賴于抗原特異性，只有抗原特異性Treg能夠有效逆轉(zhuǎn)一些自身免疫性疾?。ㄈ鏣1D、EAE）的進程［37］。因此，自身免疫性疾病特異性TCR及自身抗原的鑒定十分重要。2012年，Marek-Trzonkowska等［34］首次從患I型糖尿病的青少年體內(nèi)分離CD3+CD4+CD25hiCD127-Treg，體外擴增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Treg可以保護胰島細胞的功能，由此證明Treg在自身免疫性疾病方面的可行性。

Treg過繼轉(zhuǎn)移免疫治療所面臨的主要問題是Treg的異質(zhì)性和可塑性問題，涉及到Treg的分離純化、擴增以及輸注給患者等全部過程。Treg的異質(zhì)性主要是指依據(jù)表面標(biāo)志分子及其組合的不同而劃分為不同的亞群（subpopulation），它們在功能及作用機制上存在差異。Treg的可塑性主要是指Treg向其他輔助性T細胞轉(zhuǎn)變的潛能。Treg屬于高度異質(zhì)性的細胞群體，不僅體現(xiàn)在其發(fā)育來源以及在機體各組織器官及不同病理狀態(tài)下Treg亞群存在表型上的差異［23，38］，更重要的是體現(xiàn)在不同表面分子組合所界定的Treg亞群在表型及功能方面的差異。例如，初始Treg（CD45RA+CD25hiFOXP3lo）比效應(yīng)Treg（CD45RA-CD25hiFOXP3hi）的凋亡能力和增殖能力更強［23，39］；CD4+CD25hiICOS+Treg分泌更高水平的IL-10、IFN-γ，而CD4+CD25hiICOS-Treg的IL-2、TNF-α以及膜表面TGF-β水平更高，由此導(dǎo)致抑制機制方面的差異［40］；CD45RA+CD4+CD25hi初始Treg在體外擴增時更能穩(wěn)定表達CCR7、CC62L、CTLA-4及FOXP3，且體外擴增的Treg中CCR7+CD62L+CD45RA+CTLA4+Treg比CD45RA-CDR7-CD62L-Treg具有更強的抑制活性［41］。

目前，從外周血或臍帶血中分離供治療用的Treg還難以建立統(tǒng)一的操作規(guī)范。不同的實驗室分選分離的Treg亞群不盡相同，如CD4+CD25+T細胞、CD4+CD25hiT細胞、CD4+CD25hiCD127-T細胞等；擴增方法也不盡相同。體外擴增要盡量保持Treg純度，維持其表型和功能的穩(wěn)定。不同Treg細胞亞群及其分選和擴增方法對擴增得到的Treg純度及分泌炎癥細胞因子的效應(yīng)T細胞的含量具有顯著的影響。例如，基于磁珠分選原理的CliniMACS系統(tǒng)得到的Treg純度為40%～60%，容易污染無調(diào)節(jié)作用的效應(yīng)T細胞［42］。應(yīng)對的策略有組合多個步驟的陽選和陰選過程，以及運用流式細胞術(shù)（FACS）分選并使用相對較好的分子標(biāo)志均可以提升Treg的純度，降低效應(yīng)T細胞的污染［42-43］。由于污染細胞在體外具有擴增優(yōu)勢，使用雷帕霉素（rapamycin）等選擇性作用于效應(yīng)細胞的藥物有利于促進Treg的擴增優(yōu)勢。Treg的可塑性使得其在體外擴增或輸注到體內(nèi)所面臨的一個重要問題是：FOXP3表達的不穩(wěn)定將使得Treg向效應(yīng)T細胞（如Th17）轉(zhuǎn)變，分泌IL-17、IFN-γ等炎癥細胞因子，而體內(nèi)炎癥環(huán)境可以加速這一轉(zhuǎn)化［44-47］，從而增加過繼治療的風(fēng)險。這提示過繼治療中對擴增的Treg進行嚴(yán)格的質(zhì)控檢測以及體內(nèi)抗炎的重要性。

3 體內(nèi)誘導(dǎo)Treg的免疫治療

與抗腫瘤免疫治療中的抑制或清除體內(nèi)Treg的過程不同，體內(nèi)誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生和增強其功能適合于免疫抑制治療如器官移植、自身免疫性疾病等。Treg體內(nèi)誘導(dǎo)方式是以非抗原特異性的多克隆性Treg擴增為主，以重組蛋白、單克隆抗體、小分子化學(xué)藥物等處理以增加外周血、受累器官或移植物中Treg數(shù)量。例如，重組蛋白IL-2-IL2-mAb是由IL-2重組蛋白及其單抗JES6-1在體外等比例混合而成的復(fù)合物，可以有效增加小鼠體內(nèi)多個臟器（如肝、脾、淋巴結(jié)、胸腺等）的Treg細胞數(shù)量，擴增的Treg表現(xiàn)高度活化狀態(tài)，具有強抑制活性，可有效延遲實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（experimental allergic encephalitis，EAE）模型中小鼠發(fā)病時間，緩解小鼠癥狀，并延長胰島移植的存活時間［48］。雷帕霉素及其衍生物依維莫司（everolimus）均可以有效增加體內(nèi)、外Treg的誘導(dǎo)效果，增強IL-2-IL2-mAb的防治效果［48-49］。2014年報道的臨床II期結(jié)果顯示，超低劑量的IL-2能夠有效誘導(dǎo)體內(nèi)功能性的Treg從而有效防止造血干細胞移植導(dǎo)致的GVHD，對機體正常的細胞免疫功能無影響［50］。

單克隆抗體anti-CD25（basiliximab）、anti-CD52（alemtuzumab）、融合蛋白CTLA-4-Ig（belatacept）以及傳統(tǒng)的免疫抑制藥物如抗胸腺細胞球蛋白（anti-thymocyte globulin，ATG）、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（calcineurin inhibitors，CNI）、雷帕霉素、糖皮質(zhì)激素等都不同程度的有利于移植物、外周血或皮膚中Treg數(shù)量的增加［51-52］。蛋白激酶C（PKC）變異體特異性的抑制劑sotrastaurin（AEB071）可以促進FOXP3的轉(zhuǎn)錄，最近報道的臨床研究顯示其可以促進腎移植患者體內(nèi)Treg的擴增［53］。此外，直接針對FOXP3表達調(diào)控的小分子化合物，如組蛋白去乙?；敢种苿﹖richostatin-A（TSA）促進FOXP3的乙?；⑻岣逨OXP3的表達水平，從而增加實驗動物體內(nèi)的Treg數(shù)量，增加心臟和胰島異體移植的存活時間［54］。

PDCD5（programmed cell death 5）是本實驗室1999年報道的細胞凋亡促進基因，近期在其作用機制研究中發(fā)現(xiàn)，PDCD5蛋白可以通過結(jié)合組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶TIP60促進FOXP3的乙?；?，增強其穩(wěn)定性，進而增強Treg細胞數(shù)量和功能，對Th17和Th1細胞產(chǎn)生負調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)基因小鼠實驗證明PDCD5可以抑制自身免疫病EAE的發(fā)?。?5］。本實驗室還發(fā)現(xiàn)，利用重組PDCD5蛋白作為藥物，可以有效治療大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，其療效與抗TNF藥物ENBREL近似，而作用機制完全不同，提示重組PDCD5蛋白有可能開發(fā)為治療自身免疫病的新型藥物［56］。

目前，Treg體內(nèi)誘導(dǎo)存在的主要問題是特異性不強，如何設(shè)計出細胞特異性、信號通路特異性以及抗原特異性的靶向藥物仍有待研究。例如，TGN1412為針對CD28的單克隆抗體，可以促進Treg活化和擴增，但在臨床I期試驗發(fā)現(xiàn)TGN1412會導(dǎo)致嚴(yán)重的“細胞因子風(fēng)暴”，血清中多種細胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-8、IL-6、IL-4、IL-2、IL-1β等水平大幅度上升，出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)以致威脅生命安全［57］。后來證明是TGN1412活化了人體內(nèi)的CD4+效應(yīng)記憶細胞的緣故［58］。為解決這一問題，2014年報道重新開始的TGN1412（更名為TAB08）I期臨床試驗證明，通過控制藥物的使用劑量可以有效阻止效應(yīng)T細胞釋放炎癥因子，從而提高了對Treg作用的特異性［59］。

4 Treg免疫治療的展望

圍繞Treg為中心的免疫治療是一種新興的免疫治療策略，并在治療腫瘤、移植排斥以及自身免疫性疾病方面取得了重要進展。TGN1412的慘痛教訓(xùn)告訴我們臨床前的藥效和安全評估十分重要。雖然目前4個Treg過繼轉(zhuǎn)移臨床實驗證實了Treg的安全性，但是仍需要防范Treg治療所帶來的潛在風(fēng)險。應(yīng)重視人源化小鼠模型［60］在Treg的免疫治療中的應(yīng)用，提前合理評估以Treg為中心的免疫治療的安全性和有效性。此外，Treg的免疫治療只是綜合治療手段之一，是否作為獨立的治療手段仍需要很長的路。在針對腫瘤Treg靶向治療中，增強抗腫瘤免疫能力的同時應(yīng)不增加自身免疫性疾病的風(fēng)險，而在Treg的過繼治療中不應(yīng)增加感染和自發(fā)腫瘤的風(fēng)險。此外，鑒于近年來眾多FOXP3-調(diào)節(jié)性T細胞以及具有調(diào)節(jié)活性的B細胞、DC、巨噬細胞以及髓系來源的抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）等的發(fā)現(xiàn)及其在免疫治療中的重要作用［27，52，61］，未來將會在FOXP3+Treg基礎(chǔ)上進一步推動調(diào)節(jié)性免疫細胞在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中的研究熱潮。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.01.010

100191北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系/北京大學(xué)人類疾病基因研究中心

馬大龍，Email：madl@bjmu.edu.cn

2014-09-04