江大衛(wèi) 孫艷紅 王麗華 李劍波 張嵐

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兩種18F標記多肽方法的對比研究

江大衛(wèi)1孫艷紅1王麗華1李劍波2張嵐1

1（中國科學院上海應用物理研究所嘉定園區(qū) 上海 201800）;2（內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科 呼和浩特010050）

具有生物活性的多肽類藥物是目前醫(yī)用放射性診療藥物研發(fā)的一個熱點，開辟了核醫(yī)學分子影像劑的一個新領域。受體特異性的活性肽具有較好的藥代動力學特性，且容易進行結構修飾和放射性標記，受到受體顯像和腫瘤靶向性定位領域研究人員的廣泛關注。一些多肽類放射性藥物已經(jīng)用于臨床及臨床前試驗，且大量的多肽正有待開發(fā)。多肽的放射性標記技術經(jīng)過多年的發(fā)展，已經(jīng)建立起了系統(tǒng)的方法。通過這些方法獲得的放射性藥物不會影響多肽的生理活性。本文選用了兩種18F標記多肽的方法，通過標記條件、放化產(chǎn)率、標記物的比活度、放化純度、穩(wěn)定性及荷瘤鼠體內分布等方面對兩種標記方法進行比較研究，為18F標多肽類放射性藥物的研究提供借鑒。

18F，多肽放射性標記，[18F]SFB，Al[18F]-NOTA

目前，受體結合肽作為受體顯像試劑和靶向試劑受到廣泛的關注，在很多惡性腫瘤表面大量表達某種類型的受體，這些受體可以特異性地識別和結合靶分子多肽[1?3]。這種以受體介導的方式進入腫瘤細胞內部的多肽，通過放射性標記后，能在靶組織濃集，提供了一個較高的信噪比用于顯像[4?5]。相對于蛋白和抗體，多肽具有體積小、易標記、免疫反應小、較高的受體親和力和特異性、毒性低、體內消除快等優(yōu)勢[3?5]，是非常理想的分子探針[6?8]。

18F是一種在探針標記中被廣泛使用的正電子核素，半衰期為109.8 min，氟原子大小接近氫原子，一般用于取代氫原子，且碳氟鍵的鍵能較大，標記后相對不易脫落。這些性質使得18F標記后的多肽分子結構變化較小，活性較易保存，故而標記后的多肽分子常用于活體內生物學過程的正電子示蹤或成像。目前，氟元素對于多肽的標記常用的方法有直接偶聯(lián)法或間接標記法：其中直接偶聯(lián)包括使用親電取代或親核取代等方法直接與多肽分子進行反應，這一類方法通常需要使用較高的溫度、較強的酸堿度以及多種不同的分離條件才能夠得到產(chǎn)物；另外考慮到18F的親核取代特性，也要求多肽分子中含有特殊的氨基酸成分才能夠進行直接偶聯(lián)標記。種種要求的限制使得直接偶聯(lián)標記的方法放化產(chǎn)率較低，產(chǎn)物分離純化相對困難，所以基于此類方法的應用相對較少[9]。而間接標記法一般借助一些輔助基團或功能性螯合劑(bi-functional chelators)來實現(xiàn)多肽的氟標。由于18F的半衰期較短(109.8min)，而標記產(chǎn)物也必須滿足臨床顯像的需要，故而標記過程也必須滿足一定的條件（如反應步驟少，反應產(chǎn)率高，以及標記方法對于生物活性分子不能有破壞作用等[10]）。通過對目前相關研究的調研，據(jù)文獻中對18F標記中間體的總結情況來看，[18F]SFB（N-琥珀酰亞胺-4-[18F]氟苯甲酸酯）[11]具有優(yōu)良的體內外穩(wěn)定性及較高的反應產(chǎn)率與放化產(chǎn)率，同時反應方法在操作上較便捷，故而是一類比較適用于多肽18F標記的反應試劑。然而，人工合成[18F]SFB過程及隨后的標記反應中，一般需要進行兩次純化過程，這不僅會對操作人員造成較大的輻射劑量而存在安全隱患外，同時合成所需要的時間也相對較長。這些因素都限制了該方法的應用。近期，有相關工作報道了一種新型的標記方法，該方法主要是采用以[18F]氟化鋁一步標記多肽末端的NOTA配體（1,4,7-氮雜環(huán)壬烷-N,N',N'-四乙酸）而實現(xiàn)多肽氟標的方法[12]，此標記方法相對簡單，條件比較溫和，同時標記率也相對較高。此外，只需對標記產(chǎn)物進行一次純化，從而減少操作人員接觸放射性的時間和劑量，一定程度上減低了標記過程對實驗人員產(chǎn)生的潛在危害。本工作中，分別采用以上兩種方法，實現(xiàn)對整合素αvβ3特異性結合的小肽RGDyK進行的標記，在標記條件、放化產(chǎn)率、標記物的比活度、放化純度、穩(wěn)定性以及多肽標記化合物的生物活性等各方面對這兩種方法進行系統(tǒng)的評價，為以后多肽類藥物的氟標研究提供可能的參考及必要的信息。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

1.1.1 試劑

無水乙腈（含水量<50 mg?L?1）和Kryptofix 222 (K222)購自比利時Across公司；氫氧化四丙基胺（1mol?L?1水溶液）、4-氟苯甲酸、CH3SO3CF3以及O-(N-琥珀酰亞胺)N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸鹽(O-(N-succinimidyl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium· BF4, TSTU)等均購自Sigma-Aldrich公司；N-羥基琥珀酰亞胺(N-Hydroxy-Succinimide, NHS)與N,N’-二環(huán)己基碳酰亞胺(Di-cyclohexyl-carbodiimide, DCC) 購自日本TCI公司；CHCl3、乙酸乙酯、CF3COOH、正己烷、CH3CN、NaOH等其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，購于上海國藥化學試劑有限公司；NOTA氟化鋁試劑盒購于江蘇省原子醫(yī)學研究所；玻璃基片GF-254薄層層析硅膠板（2.5 cm×10.0 cm，煙臺匯友硅膠開發(fā)有限公司）；Sep-Pak C-18 (Plus)以及Sep-Pak硅膠柱購自于美國的Waters公司；反應瓶(Mini-Vials, 5 mL)是由美國Alltech公司生產(chǎn)。

1.1.2 儀器

旋風30型回旋加速器，比利時IBA公司；Brucker AM-300 (300 M)核磁共振儀，上海有機化學研究所；FJ-391A2 型微機放射性活度計，北京核儀器廠；高效液相系統(tǒng)(High Performance Liquid Chromatography, HPLC) Dionex P680 summmit分析系統(tǒng)，美國Dionex公司，配有Bioscan flow-count detector，美國Bioscan公司；Radio-TLC Scanner，美國Bioscan公司；WRS-1A數(shù)字熔點儀，上海滬西分析儀器廠；Υ計數(shù)率儀，上海日環(huán)廠產(chǎn)品；RE52-2旋轉蒸發(fā)器，上海滬西分析儀器廠；ZF-2型三用紫外燈，上海安亭電子儀器廠產(chǎn)品。

1.2 細胞株與動物

BALB/C小鼠（雄性，體重18?20 g）與BALB/C 裸鼠（雄性，體重14?16 g）均購于上海斯萊克實驗動物有限公司。人腦星型膠質瘤細胞株U87-MG購于中國科學院上海細胞研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 18F-SFB的合成與多肽標記

1.3.1.1 乙基-4-三甲胺苯甲酸酯-三氟磺酸鹽標記前體的合成

SFB標記前體1的合成路線如圖1所示，主要參照文獻[13]方法（有少許變動）：低溫冰浴條件下，對1.4 g (10 mmol)化合物a、1.16 g (10 mmol)化合物b和2.08 g (10 mmol) DCC三種化合物在10mL四氫呋喃(Tetrahydrofuran, THF)中反應10min，粗產(chǎn)物經(jīng)過無水乙醇重結晶可得到SFB前體，反應產(chǎn)率一般為20%。薄層色譜板層析結果顯示產(chǎn)物f值為0.80（展開劑為二氯甲烷/乙酸乙酯＝4/1）；1H-NMR (CDCl3, 300 MHz)：: 8.13?8.18 (m，2H，Ar-H)，7.26?7.21 (m，2H，Ar-H)，2.89 (s，4H， -CH2-CH2-)。

1.3.1.2 一鍋法制備[18F]SFB

利用一鍋法合成[18F]SFB的方法如圖2所示。首先，向盛有活化氟離子的反應小瓶中加入4-三甲胺苯甲酸乙酯三氟磺酸鹽（6 mg 溶于0.3 mL無水乙腈），90 oC加熱反應10 min后結束反應，待反應液冷卻后加入氫氧化四丙基胺（30 μL，1 mol?L?1的濃度溶于水中）再于90 oC條件下反應5 min。隨后加入0.5 mL乙腈后共沸蒸除水分，重復三次以保證反應體系徹底無水。再向反應瓶中加入12 mg TSTU（溶于0.25 mL乙腈中），90 oC條件下反應5 min。經(jīng)過2.5 mL 5%醋酸的酸化后，加入5 mL水進行稀釋。此后可將上述溶液通過活化后的Sep-Pak C-18小柱進行純化，用10 mL乙睛/水(:=1:7)混合液進行淋洗，經(jīng)氮氣吹干Sep-Pak C-18柱后，用2 mL的二氯甲烷進行洗脫。籍此可得[18F]SFB并進行后續(xù)的多肽標記反應。

1. 3.2.3 [18F]SFB標記多肽

將[18F]SFB溶解于50 μL的乙腈中，加入100 μg RGByk多肽（溶于200 μL pH值為8.5的0.1 mol?L?1硼砂?硼酸緩沖液），混勻后室溫下反應25 min。反應液過濾后通過高效液相色譜進行分離（所用色譜柱為Waters C-18：5 μm，9.4 mm×150 mm）。HPLC系統(tǒng)采用如下梯度方式經(jīng)過3mL?min?1的速度進行淋洗：其中A相為含0.1%三氟乙酸的乙腈、B相為含0.1%三氟乙酸的水，0?20 min時A相從16%升到90%；20?30 min，A相維持90%。收集保留時間(Retention Time, RT）在18?19.5 min處的峰。所得的產(chǎn)物溶液旋干后重新用溶解于生理鹽水中即可得到目標產(chǎn)物化合物[18F]FB-RGB。

圖2 一鍋法合成[18F]SFB路線

1.3.2 18F-AL-NOTA-RGD的制備

向3 μL 的三氯化鋁溶液（濃度為0.2 mol?L?1）和10 μL的冰醋酸中加入18F (37 MBq)離子，然后置于1 mL指型管中，加入RGDyk多肽的乙腈溶液，100 oC條件下反應10?15 min。待反應管冷卻后，將反應液經(jīng)C-18柱進行純化。純化后即可得到目標產(chǎn)物。

1.3.3 兩種標記肽的質控

分別對以上兩種標記方法的標記產(chǎn)物進行以下幾個方面的測定與考察：理化性質、化學純度、比活度、放射性化學活度以及濃度等。

制備的兩種標記化合物分別溶解于生理鹽水（0.9% NaCl溶液）中，通過目測觀察溶液的顏色、澄清度和透明度等指標。隨后用pH試紙測定兩種標記多肽溶液的pH值。最后利用放射性TLC與放射性HPLC測定兩種標記多肽溶液的放射性化學純度。另外我們使用放射性HPLC對多肽標記產(chǎn)物的放射性純度進行表征，通過參比化合物的紫外檢測限計算其比活度。

1.3.4 標記物初步的體內外生物學評價

1.3.4.1 體外穩(wěn)定性

氟標多肽產(chǎn)物在不同體系中的血清穩(wěn)定性主要通過多肽標記產(chǎn)物在37 oC條件下孵育后的放化純度變化而進行評估。我們分別檢測了兩種標記化合物在磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution, PBS)和牛源的血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)中的穩(wěn)定性，用Radio-HPLC法分析其放化純度[14]，液相條件為：A相為乙腈溶液（含0.1% 三氟乙酸）、B相超純水（含0.1% 三氟乙酸），在0?10 min時，A相含量從80%降到20%；隨后在10?20 min時，A相從20%升至80%。

方法1（PBS 法）：取兩種氟標多肽產(chǎn)物溶液(100 μL，0.37 kBq)與1 mL PBS（濃度0.1 mol?L?1，pH 7.4）進行混合，37 oC下分別孵育30 min、60 min、90 min、120 min、180 min、240min、300 min和360min 后，用放射性HPLC測定其放射化學純度，以觀察其體外穩(wěn)定性。

方法2（BSA 法）：取兩種氟標多肽產(chǎn)物溶液(100 μL，0.37 kBq)與1 mL BSA進行混合，37 oC下孵育30 min、60 min、90 min、120 min、180 min、240 min、300 min和360 min后，用放射性HPLC測定溶液的放化純度，以觀察氟標多肽的體外穩(wěn)定性。

1.3.4.2 體內穩(wěn)定性

通過尾靜脈注射的方法將兩種氟標多肽溶液(100 μL，3.7 MBq)注入Balb/c小鼠體內(=3)，注射后的30 min、60 min以及90 min處死小鼠并取血，血液收集后離心分離以獲得血漿。向200 μL血漿中加入200 μL甲醇/三氯甲烷(:＝4:1)，充分混合后離心取上清液進行Radio- HPLC分析。

1.3.4.3 荷瘤鼠體內生物分布

首先制備膠質瘤細胞荷瘤鼠，采用裸鼠，體重14?16 g，左側腋下注射膠質瘤細胞U87-MG細胞，每只100 μL，約5×106個細胞，正常飼養(yǎng) 2?3周，腫瘤直徑達0.8?1 cm時，進行實驗。兩種氟標多肽溶液(100 μL，3.7 MBq)分別通過尾靜脈注射進入荷瘤鼠體內，兩組各6只腫瘤鼠分別于注射后10 min與60 min處死，解剖后取臟器進行放射性計數(shù)（主要臟器包括腫瘤塊、心臟、肝臟、腦部、肺部、腎臟、胃部、腸道以及血液），在稱量各組織重量后計算%ID/g組織（每克組織的放射性劑量占注射總劑量的百分比含量，% Injected Dose per gram tissue），即得到各個臟器對標記多肽產(chǎn)物的攝取值。

2 結果

2.1 標記條件及標記物質控結果對比

由表1可知，[18F]SFB作為傳統(tǒng)的18F標記方法已經(jīng)有被更簡單的新方法取代的變化趨勢。相對于[18F]-FB-RGD，18F-AlF-NOTA大大縮短了標記時間，20 min 內一步反應可以完成整個標記過程，且放化產(chǎn)率也有顯著提高。對于半衰期只有110 min的18F核素來說，這些優(yōu)勢使得此類方法必將在18F標記藥物的研發(fā)中得到研究人員的重視，也為日后臨床推廣奠定了基礎。但采用C-18柱純化的方法獲得的標記物比活度相對較低，對進一步發(fā)展有一定的阻礙，需要進行針對性的優(yōu)化。

表1 兩種方法標記多肽后的產(chǎn)物對比

2.2 體內外穩(wěn)定性

由圖3可以比較兩種多肽標記產(chǎn)物在實驗檢測項目中的穩(wěn)定性情況：兩種標記物在體外條件下均相對穩(wěn)定。在PBS中6 h的孵育時間后，兩種標記物的放化純度均能保持90%左右，而在BSA中，推測由于血中某些物質與標記物中的多肽產(chǎn)生相互作用，因此放化純度相比PBS中稍低，6 h后只能保持80%。而在體內環(huán)境下，標記物被分解及代謝等原因，60 min后只有73%的放化純度，而90 min后放化純度不足60%?？傮w而言，兩種標記物的穩(wěn)定性沒有顯著性差異，但相比較而言，18FB-RGD在實驗條件內的穩(wěn)定性更好些，這可能是由標記方法的不同所造成的，相對于螯合作用得到的Al18F-NOTA-RGD，S18FB?；玫降?8FB-RGD更穩(wěn)定。

2.3 體內分布

兩種標記物在荷瘤鼠體內分布的數(shù)據(jù)見表2。兩種標記化合物進入模型鼠體內后都能迅速地靶向腫瘤部位，相對大多數(shù)正常的組織器官，放射性在腫瘤部位有較高的濃集，注射后10 min，18FB-RGD與Al18F-NOTA-RGD在腫瘤組織攝取量分別為3.69±0.08 %ID?g?1和3.59±0.26 %ID?g?1。注射60 min后，18FB-RGD與Al18F-NOTA-RGD在腫瘤組織的攝取量分別為1.97±0.08 %ID?g?1和1.78±0.34 %ID?g?1，對腫瘤的靶向性很好，都具有較高的靶/非靶比(圖4)，在腫瘤部位滯留時間較長，注射后60 min仍有較高的攝取。兩種標記物在肝臟和腎臟分布較多，這主要是由于藥物主要通過肝臟和腎臟代謝。而心臟、腦部、脾臟、肺部以及肌肉等主要臟器位置的放射性攝取量相比遠低于腫瘤部位。而且兩種標記產(chǎn)物在骨骼中沒有明顯的攝取，表明兩種化合物在體內均沒有發(fā)生脫氟現(xiàn)象。

表218FB-RGD與Al18F-NOTA-RGD在荷瘤小鼠組織(%ID?g?1)中的分布對比(10 min和60 min)

3 討論

在[18F]SFB的多肽標記實驗中，由于是多步間接法，故而主要的標記時間耗費在前體的標記合成中，對于18F這類短半衰期核素，標記時間應該盡可能縮短。而Al18F-NOTA的多肽標記實驗中，我們可以采用市售的標記試劑盒，標記步驟由 [18F]SFB方法的兩步反應簡化成一步反應，反應時間由150 min顯著縮短至20 min左右，這一點對于實驗室標記來說提供了極大的便利，而且放化產(chǎn)率由(8.5±2.3)%升高至(15±3.3)%，正是受益于標記步驟的簡化與標記時間的極大縮短，此方法所制備的放化產(chǎn)率相對更高。相比[18F]SFB的多肽標記方法，Al18F-NOTA制備的產(chǎn)物比活度較低，主要是因為純化時使用較簡單的C-18小柱。后續(xù)如果對純化手段進行進一步的研究與開發(fā)，此方法可以更好地滿足實驗室研究與臨床前實驗的需求。

在體外與體內穩(wěn)定性的研究中，我們發(fā)現(xiàn)兩種方法標記得到的RGD多肽穩(wěn)定性良好，兩種標記方法的穩(wěn)定性之間沒有顯著性差異。360 min后能在PBS和BSA中標記化合物能有80%以上保持穩(wěn)定。在小鼠體內，注射后60 min能有70%以上保持穩(wěn)定，90 min有60%以上保持穩(wěn)定。

在腫瘤鼠模型的臟器分布實驗中，我們發(fā)現(xiàn)18FB-RGD與Al18F-NOTA-RGD均具備較優(yōu)的腫瘤靶向能力：兩種多肽在尾靜脈注射后10 min的腫瘤與肌肉比分別為14.2與17.1，尾靜脈注射60 min后腫瘤與肌肉比分別為19.7與11.1，兩種多肽在測試時間點內于腫瘤部位的濃集均較顯著(圖4)，這種濃集在注射后1 h仍然較高。兩種方法標記的多肽在體內具備比較一致的代謝途徑與分布性質，肝、腎臟部位分布較多，表明兩種標記化合物主要通過肝臟和腎臟進行代謝，其他的臟器如心、肺、脾、肌肉、腦等臟器有較少的分布，同時兩種標記多肽產(chǎn)物均能實現(xiàn)較好的腫瘤組織靶向。

4 結語

本文所采用的兩種標記方式均可以實現(xiàn)18F對生物活性多肽的放射性標記，標記方法Al18F-NOTA更方便快捷，適合臨床前早期的基礎研究應用。兩種方法得到的標記產(chǎn)物在穩(wěn)定性以及生物活性等方面的差異均不明顯，同時兩種標記產(chǎn)物都能實現(xiàn)針對腫瘤部位的特異性靶向，且通過肝臟和腎臟代謝，能夠快速從血液及非靶的正常組織器官中排出，基本可以實現(xiàn)針對各種臨床前實驗需求的滿足。但18FB-RGD的比活度更高，穩(wěn)定性由于標記方法不同略有差異，但差異不顯著。目前，在有條件的研究組已經(jīng)實現(xiàn)了S18FB的模塊自動化合成，可大劑量生產(chǎn)，同時減少了對實驗操作人員的輻射劑量，這些進展均為此方法應用范圍的擴大提供了保障。而Al18F-NOTA方法在小規(guī)模臨床前實驗中的優(yōu)勢更明顯。兩種方法均存在優(yōu)化的空間，通過化學手段的不斷完善，可以為放射性藥物研究提供更寬廣的平臺。

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Comparison study of two18F labeling methods of peptides

JIANG Dawei1SUN Yanhong1WANG Lihua1LI Jianbo2ZHANG Lan1

1(Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences, Jiading Campus, Shanghai 201800, China);2(Department of Nuclear Medicine, Inner Mongolia Medical University Affiliated Hospital, Hohhot 010050, China)

Background:Some radiopharmaceuticals based on peptides have been applied in preclinical and clinical trials, in the meantime, a large number of peptides are to be exploited. After years of development, radiolabeling techniques of peptides have progressed to be a system method. Through these methods of radiolabeling, peptides’ physiological activities would be influenced. Purpose: In this paper, we summarized two current commonly used18F labeling methods for preparation of radiopharmaceuticals based on peptides. Methods: By comparison of labeling conditions, radiochemistry yields, specific activity of labeling products, radiochemistry purity, stability and pharmacokinetics of final products, we evaluated advantages and disadvantages of the two methods, with the hope to provide reference data for future research of18F-labeled peptide radiopharmaceuticals. Results: Both [18F]SFB and Al18F-NOTA could readily label RGDyk peptide with18F, with a radiochemistry yield of about 8.5% and 15%, respectively. [18F]SFB could produce radiolabeled peptides with better specific activity, while Al18F-NOTA proved to be a more time-saving method. For stability test, more than 80% of both [18F]SFB and Al18F-NOTA could maintain intact in PBS (Phosphate Buffer Solution) or BSA (Bovine Serum Albumin) within 360 min, and about 50% radiolabeled peptides could survive. Conclusion: Theandstability of [18F]-RGD obtained with both methods were excellent, and biodistribution pattern of radiolabeled productstwo methods did not show obvious differences.

18F, Radiolabeling of peptides, [18F]SFB, Al[18F]-NOTA

TL12

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10.11889/j.0253-3219.2015.hjs.38.070301

國家自然科學基金(No.81360227、No.10875163)、中國科學院戰(zhàn)略重點研究項目(No.XDA02030000)資助

江大衛(wèi)，男，1988年出生，2015年于中國科學院上海應用物理研究所獲博士學位

李劍波，Email: lijianbo_1235@163.com；張嵐，E-mail: zhanglan@sinap.ac.cn

2015-03-10，

2015-04-10