劉 晏，魏 剛，朱豐林，郭云柯，平 凡，景嶸月，陸兔林，郭海英，汪 悅

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210029）

新痹痛靈對(duì)小鼠免疫功能的影響

劉 晏，魏 剛，朱豐林，郭云柯，平 凡，景嶸月，陸兔林，郭海英，汪 悅*

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210029）

目的 觀察新痹痛靈對(duì)小鼠免疫功能的影響。方法 將小鼠隨機(jī)分為空白組、陽(yáng)性藥組、新痹痛靈低劑量組、新痹痛靈高劑量組，通過計(jì)算廓清指數(shù)，觀察新痹痛靈對(duì)小鼠非特異性免疫方面的影響；采用血清溶血素試驗(yàn)法以及二硝基氯苯誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)法，觀察新痹痛靈在特異性免疫方面的作用。結(jié)果 新痹痛靈能調(diào)整小鼠的碳粒廓清吞噬指數(shù)、減少血清溶血素抗體的生成、抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生。結(jié)論 新痹痛靈能不同程度的在非特異性免疫和特異性免疫兩個(gè)方面有免疫抑制作用。

新痹痛靈；免疫功能；碳粒廓清；溶血素；遲發(fā)型超敏反應(yīng)

新痹痛靈是從全國(guó)名老中醫(yī)汪履秋教授治療中醫(yī)“痹證”（尤其是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）的經(jīng)驗(yàn)方變化而來，由朱丹溪上中下通用痛風(fēng)方化裁，在結(jié)合了前期的實(shí)驗(yàn)及臨床研究后總結(jié)而出［1-4］。為進(jìn)一步研究新痹痛靈對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)分別從非特異性免疫和特異性免疫兩個(gè)方面，對(duì)新痹痛靈進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)BALB／C、ICR雄性小鼠（血清溶血素試驗(yàn)使用ICR小鼠，其余試驗(yàn)采用BALB／C小鼠），體質(zhì)量（20±2）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXX（京）2012-0001。豚鼠（200±20）g，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXX（蘇）2012-0008。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房，室內(nèi)溫度（22±1）℃，濕度（55±5）% ，12 h光暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)時(shí)間均大于1周，其飼料和水在消毒后均由動(dòng)物自由攝取。

1.2 藥物、試劑與制備 新痹痛靈藥材購(gòu)于江蘇省中醫(yī)院門診部藥房，制作程序由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院研制，經(jīng)江蘇省中醫(yī)院制劑部加工。具體提取方法：本方共6味藥，取桂枝、防風(fēng)用10倍量水浸泡2 h，水蒸汽蒸餾6 h，提取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油、水提液及藥渣以備用。取麻黃、青風(fēng)藤用16倍量50%乙醇提取3次，每次2 h，合并醇提液，過濾、收集醇提液及藥渣以備用。最后將以上4味藥藥渣合并另2味藥一同加入20倍量水中，提取2次，2 h／次，合并水煎液，與之前備用的揮發(fā)油水提液合并，加乙醇至含醇量50% ，靜置48 h，上清液與醇提液合并，減壓回收乙醇至無醇味的清膏，折合原藥材為每1g浸膏含生藥量為10.75 g。雷公藤多苷片（浙江得恩德制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)1403111B）。

試劑及配置：印度墨汁，Solarbio公司生產(chǎn)，批號(hào)08C021；二硝基氯苯（簡(jiǎn)稱DNCB），SIGMA公司生產(chǎn)，批號(hào)C3762；伊文斯藍(lán)，SIGMA提供，批號(hào)E2129；30% BrijL23 solution，SIGMA公司生產(chǎn)，批號(hào)SLBH6355V；都氏試劑，SIGMA公司生產(chǎn)，批號(hào)SLBF9046V，臨用時(shí)以1 VL∶1 000 mL雙蒸水稀釋成都氏溶液，然后加入0.5 mL的30%BrijL23溶液備用。

綿羊紅細(xì)胞（SRBC，玉環(huán)縣南方試劑廠生產(chǎn)，批號(hào)NF-242），臨用前用生理鹽水洗滌，2 000 r／min條件下離心5 min，棄用上清液，如此洗滌3次，最后以體積比3∶5用生理鹽水稀釋備用；豚鼠血清制備：取3只豚鼠血，離心后取血清，并在-20℃中保存，使用之前用生理鹽水1∶10稀釋。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀，PerKin Elmer生產(chǎn)，批號(hào)：23000353；HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司生產(chǎn)；5810型臺(tái)式大容量高速離心機(jī)，德國(guó)eppendortf公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 分組與給藥 雄性ICR小鼠分為空白組、陽(yáng)性藥組、痹痛靈低劑量組、痹痛靈高劑量組，每組10只，分別予生理鹽水0.2 mL／10 g，雷公藤多苷片溶液0.012 g／kg，新痹痛靈浸膏溶液3.95、15.8 g生藥／kg體質(zhì)量。

2.2 對(duì)非特異性免疫功能的影響——碳粒廓清實(shí)驗(yàn)［5］連續(xù)給藥7 d，末次給藥30 min后，從小鼠尾靜脈以0.1 mg／10 g體質(zhì)量注射印度墨汁（印度墨汁用前以生理鹽水稀釋10倍），分別于0.5、6 min從右眼眶后靜脈叢取血0.1 mL，再用移液器取25 μL溶于2 mL0.1%NA2CO3溶液中，充分洗出吸管壁附著之血液，搖勻。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前取一空白小鼠血液25 μL，溶于2 mL 0.1%NaCO3液校零，酶標(biāo)儀600 nm得出OD值即吞噬速率。最后將小鼠脫臼處死，分別稱取肝脾重量，計(jì)算廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α。

2.3 對(duì)特異性免疫功能的影響——溶血素實(shí)驗(yàn)［6］連續(xù)給藥7 d，給藥第1天后于BALB／C小鼠腹腔注射20%SRBC 0.2 mL／只，第7天給藥后1 h眼眶取血，分離血清，以NS稀釋200倍后供測(cè)定。反應(yīng)管內(nèi)依次加入經(jīng)稀釋的小鼠血清1 mL、5%SRBC 0.5 mL、10%豚鼠血清1 mL，對(duì)照管內(nèi)1次加入生理鹽水1 mL、5%SRBC 0.5 mL、10%豚鼠血清1 mL。兩管均置于37℃恒溫水浴中保溫10 min，然后移至冰浴中終止反應(yīng)，2 000 r／min離心10 min，取上清液1 mL加入3 mL都氏試劑；另取一管，加入4 mL都氏試劑和0.25 mL 5%SRBC，各試管搖勻放置10 min，酶標(biāo)儀（540 nm分別測(cè)定各管吸收度值OD）。計(jì)算公式：HC 50＝樣品的吸光度值／SRBC半數(shù)溶血值×稀釋倍數(shù)。

2.4 對(duì)特異性免疫功能的影響——遲發(fā)型超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)［7-8］首次給藥后以脫毛劑去ICR小鼠背部頸毛，第2天用移液器在給藥組頸部皮膚上滴50% DNCB丙酮溶液2 μL／只致敏；空白組涂PBS溶液作為對(duì)照。連續(xù)給藥12 d，于末次給藥后1 h，在脫毛后的小鼠腹部皮膚上用20 μL的2.5%DNCB丙酮溶液進(jìn)行攻擊；24 h后（第13天），按照0.01 mL／g的計(jì)量，給每只小鼠尾靜脈注射1%的伊文斯藍(lán)，注射30 min后，頸椎脫臼處死小鼠，取下腹部藍(lán)染皮膚剪碎，置于試管中，用5 mL的1∶1丙酮生理鹽水混合液浸泡，24 h后（第14天）以3 000 r／min離心10 min，取上清液處比色，酶標(biāo)儀（610 nm）測(cè)吸光度OD值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0軟件，組間比較采用χ2分析。

3 結(jié)果

3.1 碳粒廓清實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表1。

3.2 溶血素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表2。

表1 新痹痛靈對(duì)小鼠廓清指數(shù)的影響（±s，n＝10）

表1 新痹痛靈對(duì)小鼠廓清指數(shù)的影響（±s，n＝10）

注：與空白組比較 ，＃P＜0.05

組 別 K值 α值?？瞻捉M 0．087±0．004 7．98±0．18陽(yáng)性藥組 0．059±0．008＃ 6．71±0．35＃低劑量組 0．082±0．005＃ 7．44±0．13＃高劑量組 0．068±0．004＃ 7．23±0．17

表2 新痹痛靈對(duì)綿陽(yáng)紅細(xì)胞所致小鼠溶血素抗體形成的影響（±s，n＝10）

表2 新痹痛靈對(duì)綿陽(yáng)紅細(xì)胞所致小鼠溶血素抗體形成的影響（±s，n＝10）

注：與空白組比較 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組 別 HC50 組 別 HC50空白組 0．130 2±0．042 2 低劑量組 0．116 8±0．029 8＃＃陽(yáng)性藥組 0．077 9±0．019 8＃＃ 高劑量組 0．087 9±0．021 5

3.3 遲發(fā)型超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表3。

表3 新痹痛靈對(duì)DNCB所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響（±s，n＝10）

表3 新痹痛靈對(duì)DNCB所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響（±s，n＝10）

注：與空白組比較 ，＃P＜0.05

組 別 D（λ＝610nm） 組 別 D（λ＝610nm）空白組 0．1266±0．0172 低劑量組 0．0962±0．0121＃陽(yáng)性藥組 0．0838±0．0191＃ 高劑量組 0．0836±0．0143＃

4 討論

血液中碳粒的消失速度可反應(yīng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬異物的能力，從而證明其防御功能的強(qiáng)弱［9］。本實(shí)驗(yàn)選用碳粒廓清實(shí)驗(yàn)體現(xiàn)新痹痛靈對(duì)正常小鼠非特異性免疫功能的影響。印度墨汁作為異物顆粒注射入血，被單核吞噬細(xì)胞迅速吞噬清除［10］。廓清指數(shù)（K）網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞對(duì)異物的吞噬廓清能力和速度，吞噬指數(shù)（α）在排除了肝、脾重量對(duì)K值影響的情況下 ，反應(yīng)了網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的功能狀態(tài)［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新痹痛靈低、高劑量均對(duì)正常小鼠的廓清指數(shù)有顯著影響。

經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠，其淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生特異性的抗綿羊紅細(xì)胞抗體，然后釋放至外周血［12］?？贵w在體外與綿陽(yáng)紅細(xì)胞及補(bǔ)體一同溫浴 ，可發(fā)生溶血反應(yīng) ，并釋放出血紅蛋白［13］。通過測(cè)定溶血過程中釋放出的血紅蛋白量可以計(jì)算出致敏動(dòng)物血清中溶血素的含量。而紅細(xì)胞的溶血程度又與抗體的含量呈正相關(guān)，故通過對(duì)上清液的光密度的測(cè)定，可間接測(cè)定抗體的數(shù)量［14］。結(jié)果表明，新痹痛靈低、高劑量均能降低血清溶血素含量，但高劑量的作用更為顯著。

DNCB是一種半抗原，其稀釋液可與小鼠腹部皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，從而刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞，DNCB誘導(dǎo)的DTH模型對(duì)研究細(xì)胞免疫有重要意義［15-16］。本實(shí)驗(yàn)在致敏12 d后進(jìn)行抗原攻擊，將DNCB涂抹在皮膚，一般24～48 h反應(yīng)達(dá)到高峰 ，用比色法對(duì)皮片的吸光度進(jìn)行比較［17］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新痹痛靈能明顯抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，說明新痹痛靈對(duì)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫有一定抑制作用。

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Xinbitongling on mice immune function

LIU Yan，WEI Gang，ZHU Fenglin，GUO Yunke，PING Fang，JING Rongyue，LU Tulin，GUO Haiying，WANG Yue*
（Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China）

Objective To observe the effect of the New Bitongling on immune regulation in mice．Methods Mice are randomly divided into blank group，positive drug group，low dose of New Bitongling group and high dose of New Bitongling．Through calculating phagocytic index，effects of New Bitongling on non-specific immunomodulating effects on mice are observed．Hemolysin test and dinitrofluorobenzene-induced delayed type hypersensitivity test（DTH）are used to observe effects of New Bitongling on non-specific immunomodulating effects on mice．Results The New Bitongling Compound can decrease the index the number of K and α，reduce the generation of serum hemolysin antibody，and inhibit dinitrofluorobenzene-induced delayed type hypersensitivity reaction．Conclusion The New Bitongling Compound can suppress the two aspects of nonspecific immunity and specific immunity in mice in different degree．

Xinbitongling；immunologic function；carbon clearance test；hemolysin；DTH

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0908-03

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．009

2015-02-04）

國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)痹病學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放基金資助項(xiàng)目（BBXK2013106）；康緣中醫(yī)藥科技創(chuàng)新項(xiàng)目計(jì)劃（KZ1003KY）。

劉 晏（1989-），女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)內(nèi)科學(xué)風(fēng)濕免疫臨床研究。

*通信作者：汪 悅，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，電子信箱-wangyuephd＠126．com