劉東慧，侯麗娜，喬志燕，陳志宏△

（1.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）

2型糖尿病大鼠肝臟肝細(xì)胞核因子-4α表達(dá)的變化*

劉東慧1，侯麗娜1，喬志燕2，陳志宏1△

（1.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）

目的：探討2型糖尿病大鼠肝臟肝細(xì)胞核因子-4α（HNF-4α）表達(dá)的變化和意義。方法：24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組和糖尿病模型組，每組12只大鼠。鏈脲佐菌素連續(xù)腹腔注射法制作2型糖尿病大鼠模型。采用SP免疫組織化學(xué)染色、Western Blotting法、RT-PCR法檢測大鼠肝臟HNF-4α的表達(dá)情況。結(jié)果：與正常對照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠肝臟HNF-4α蛋白和mRNA的表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）。結(jié)論：肝臟HNF-4α表達(dá)的升高可能參與了2型糖尿病時(shí)肝臟損傷的發(fā)生發(fā)展。

2型糖尿?。桓闻K；肝細(xì)胞核因子-4α（HNF-4α）

糖尿病肝病是指由糖尿病引起的肝臟組織學(xué)變化以及功能變化的病變，包括肝硬化、脂肪肝和肝炎等，其中以非酒精性脂肪性肝病最為常見［1］。臨床上糖尿病導(dǎo)致的肝臟病變，引起肝纖維化、肝硬化并不少見，使患者血糖水平發(fā)生劇烈波動(dòng)：空腹低血糖、餐后高血糖，胰島素反復(fù)調(diào)整用量也不易控制，低血糖昏迷和糖尿病酮癥酸中毒的發(fā)生率升高，甚至出現(xiàn)生命危險(xiǎn)［2-3］。因此，重視糖尿病患者肝臟并發(fā)癥的防治和肝功能的保護(hù)，對減少糖尿病患者的并發(fā)癥提高患者生活質(zhì)量具有積極意義。為深入研究糖尿病時(shí)肝臟損傷的發(fā)生機(jī)制，本研究采用免疫組化染色、Western Blotting法和RT-PCR法檢測了2型糖尿病模型大鼠肝臟肝細(xì)胞核因子-4α（HNF-4α）表達(dá)的變化，以期為糖尿病并發(fā)癥的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理 清潔級雄性SD大鼠，合格證號712024，體質(zhì)量200-250g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。24只大鼠隨機(jī)分為以下2組：①正常對照組，12只，大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不做處理。②糖尿病模型組，12只，建立2型糖尿病大鼠模型。建立模型的方法：2%鏈脲佐菌素（25mg/ kg）每天一次連續(xù)腹腔注射3d，注射鏈脲佐菌素后7d以空腹血糖≥16.7mmol/L作為模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 鏈脲佐菌素，美國Sigma公司；HNF-4α兔抗大鼠多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色液，武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體，美國Santa Cruz公司；Trizol，美國Invitrogen公司；HNF-4α引物，上海生工生物工程有限公司；RT-PCR試劑盒，北京天根生化科技有限公司。

1.3 取材及檢測血糖水平 4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血，離心取血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。大鼠取血后處死，取肝臟，部分入Bouins液固定，部分入液氮速凍后移入-80℃冰箱保存。

1.4 肝臟HNF-4α蛋白表達(dá)的檢測

1.4.1 免疫組織化學(xué)染色及定量分析：Bouins液固定肝臟常規(guī)石蠟包埋，5μm厚連續(xù)切片。采用SP免疫組化法，HNF-4α一抗1：100稀釋，陰性對照為PBS代替一抗，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒至棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞標(biāo)志。每組隨機(jī)選取12張切片，每張切片在10×40倍顯微鏡下選取肝臟視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對HNF-4α陽性產(chǎn)物的IOD值進(jìn)行定量分析。

1.4.2 Western Blotting法：取30mg液氮中保存的肝臟組織勻漿提取蛋白，蛋白濃度的確定使用二喹林甲酸蛋白試劑盒，8%積層膠和14%分離膠電泳，HNF-4α蛋白上樣量60μg，4℃、2mA/cm2轉(zhuǎn)膜2h，5%脫脂奶粉封閉過夜，一抗（HNF-4α 1：100，β-actin 1：1 000）室溫孵育2h，二抗（1：5000）1h，Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。膠片掃描后，采用Quantity One 4.6.2軟件對顯影條帶進(jìn)行分析，計(jì)算目的條帶與β-actin條帶的灰度比值，作為HNF-4α蛋白的相對表達(dá)水平。

1.5 肝臟HNF-4α mRNA表達(dá)的檢測 取100mg液氮保存肝臟組織，提取總RNA。取3μg總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為：42℃孵育3min；加入反應(yīng)液Mix，42℃孵育15min；99℃反應(yīng)3min。PCR反應(yīng)條件：94℃，2min；94℃，30s；59℃，30s；72℃，1min，第2步起循環(huán)。PCR引物序列及擴(kuò)增條件見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝片，并用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行定量分析，以HNF-4α條帶吸光度與β-actin條帶吸光度的比值，作為HNF-4α mRNA的相對表達(dá)水平。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增條件

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的血糖水平 與正常對照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠的血糖水平明顯升高（P＜0.01）。見表2：

表2 各組大鼠的血糖水平和肝臟HNF-4α的表達(dá)（±s，n=12）

表2 各組大鼠的血糖水平和肝臟HNF-4α的表達(dá)（±s，n=12）

與糖尿病模型組比較：*P＜0.01

組別 　　血糖（mmol/L） 肝臟HNF-4α蛋白表達(dá)肝臟HNF-4α mRNA表達(dá)免疫組化法 　Western Blotting法正常對照組 　10.83±2.03*　9436.679±292.681*　0.025±0.002*　0.499±0.036*糖尿病模型組 　29.45±4.82 　37822.262±331.429 　0.043±0.002 　0.903±0.012

2.2 各組大鼠肝臟HNF-4α的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，HNF-4α免疫陽性產(chǎn)物為棕褐色，位于肝細(xì)胞的細(xì)胞核。免疫組化染色法、Western Blotting法、RT-PCR法定量分析結(jié)果見表2：與正常對照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠肝臟HNF-4α蛋白和mRNA的表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）。

3 討論

肝細(xì)胞核因子-4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF-4α）在肝臟高度表達(dá)，是核受體超家族配基激活型轉(zhuǎn)錄因子的高度保守成員之一，屬孤受體范疇［3］；HNF-4α具有脂溶性激素受體的特性，能夠直接進(jìn)入胞核調(diào)節(jié)肝臟、胰島代謝相關(guān)基因的表達(dá)［4］。國內(nèi)外大量的研究證明，HNF-4α與2型糖尿病之間存在密切的關(guān)聯(lián)，并與胰島素抵抗有一定關(guān)系：1.HNF-4α可調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)糖異生途徑中限速酶之一的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因特異性表達(dá)，并可直接調(diào)節(jié)肝臟糖異生的效率［5-6］。2.HNF-4α是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2、醛縮酶B、丙酮酸激酶基因表達(dá)所必需的，對葡萄糖攝取、肝糖異生及糖酵解途徑有重要意義［7］。3.HNF-4α可能通過刺激胰島素合成及釋放、抑制肝糖原異生、促進(jìn)葡萄糖攝取以及促進(jìn)糖酵解等作用參與血糖調(diào)節(jié)［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素致2型糖尿病大鼠模型肝臟HNF-4α蛋白的表達(dá)水平明顯升高，與Oyadomari等的研究結(jié)果一致［9］。因此提示，HNF-4α可能參與了2型糖尿病肝臟損傷的發(fā)生發(fā)展。

［1］Matafome P， Louro T， Rodrigues L， et al. Metformin and atorvastatin combination further protect the liver in type 2 diabetes with hyperlipidaemia［J］. Diabetes Metab Res Rev， 2011， 27（1）：54-62.

［2］徐麗英，何偉峰，梁小仲.TNF-α與肝源型糖尿病的相關(guān)性研究［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2013，11（7）：78-80.

［3］宋景春，李志超.肝細(xì)胞核因子-4與MODY［J］.國外醫(yī)學(xué)-內(nèi)分泌學(xué)分冊，2001，1（21）：13-15.

［4］Odom DT， Zizlsperger N， Gordon DB. Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors［J］. Science，2004， 303（5662）： 1378-1381.

［5］Hayhurst GP， Lee YH， Lambert G， et al. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha （nuclear receptor 2A1） is essential for maintenance of hepatic gene expression and lipid homeostasis［J］. Mol Cell Biol， 2001， 21（4）： 1393-1403.

［6］Yoon JC， Puigserver P， Chen G， et al. Control of hepatic gluconeogenesis through the transcriptional coactivator PGC-1［J］. Nature， 2001， 413（6852）： 131-138.

［7］高志強(qiáng)，陸付耳，冷三華，等.小檗堿對高果糖飼養(yǎng)誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠肝組織HNF-4α表達(dá)的影響［J］.世界華人消化雜志，2008，16（15）：1681-1684.

［8］Parviz F， Matullo C， Garrison WD， et al. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha controls the development of a hepatic epithelium and liver morphogenesis［J］. Nat Genet， 2003， 34（3）：292-296.

［9］Oyadomari S， Matsuno F， Chowdhury S， et al. The gene for hepatocyte nuclear factor（HNF）-4alpha is activated by glucocorticoids and glucagon， and repressed by insulin in rat liver［J］. FEBS Lett， 2000， 478（1-2）： 141-146.

CHANGES OF HEPATOCYTE NUCLEAR FACTOR 4 ALPHA EXPRESSION IN LIVER OF TYPE 2 DIABETES MELLITUS RATS

LIU Dong-hui， HOU Li-na， QIAO Zhi-yan， et al

（Department of Human Anatomy， Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective：To investigate changes and signifi cance of hepatocyte nuclear factor 4 alpha （HNF-4α） in liver of type 2 diabetes mellitus rats model.Methods：24 male SD rats were randomly divided into normal control group and diabetes model group with 12 rats in each group. The type 2diabetes model rats were induced by continuous intraperitoneal injection of streptozotocin. SP immunohistochemical stain， Western Blotting and RT-PCR were used to detect HNF-4α expression in liver. Results： Compared with rats in normal control group， the HNF-4α protein and mRNA expression in liver of rats in diabetes model group increased obviously （P＜0.01）. Conclusions： High expression of HNF-4α may participate development of liver injury during diabetes mellitus.

Type 2 diabetes mellitus； Liver； Hepatocyte nuclear factor 4 alpha （HNF-4α）

R587.1

A

1004-6879（2015）02-0100-03

2014-09-03）

* 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81441133），河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（H2013406096），河北省高校重點(diǎn)發(fā)展學(xué)科“人體解剖與組織胚胎學(xué)”建設(shè)項(xiàng)目資助