李佳 雷豪志 代彬 其其格 張益 胡鈞

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硅油對(duì)淀粉樣蛋白和多肽積聚的促進(jìn)作用

李佳1雷豪志1代彬2其其格1張益1胡鈞1

1（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所微觀界面物理與探測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室嘉定園區(qū) 上海 201800）;2（中國(guó)科學(xué)院生物與化學(xué)交叉中心 上海200032）

本文研究了硅油對(duì)淀粉樣蛋白和多肽積聚的影響，采用硫磺素T(ThT)熒光分析法和原子力顯微鏡表征。結(jié)果顯示，5種淀粉樣蛋白/多肽在含有硅油的體系中積聚更快、更充分，表明一定量的硅油能促進(jìn)這些淀粉樣蛋白/多肽的積聚。此外，研究了渦旋操作對(duì)硅油污染的引入。結(jié)果表明，渦旋能將離心管內(nèi)壁的硅油引入溶液中，從而促進(jìn)GAV9肽的積聚。

硅油，淀粉樣蛋白，渦旋，積聚

淀粉樣蛋白類疾病吸引了無(wú)數(shù)科學(xué)家的興趣，被Lednev稱為世界第八大奇跡[1]。其中，親-疏水界面對(duì)淀粉樣蛋白和多肽的影響，自1994年起就陸續(xù)有文章報(bào)道[2–7]。蛋白單體不僅富集在親-疏水界面上，并且在界面上采取有助于積聚的構(gòu)象和排列，甚至宏觀氣液界面[8]也可顯著促進(jìn)a-Syn的積聚。

水中的硅油微粒表面也是一種疏水界面，但硅油對(duì)淀粉樣蛋白和多肽積聚的影響，尚未有報(bào)導(dǎo)。硅油是一類聚硅氧烷，呈疏水性，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)療和日常用品中，通常認(rèn)為是對(duì)人體安全無(wú)害的。在眼科手術(shù)和美容整形中，常使用硅油作為填充物。但是眼科手術(shù)填充硅油后頻頻出現(xiàn)一些并發(fā)癥，以白內(nèi)障較為突出，目前發(fā)病機(jī)制并不清楚。在王若芳等[9]發(fā)表的一篇綜述中，歸納了可能相關(guān)的7個(gè)因素，但是并沒有提及硅油促進(jìn)淀粉樣蛋白積聚這一因素；而白內(nèi)障的發(fā)生，與晶狀體蛋白(Crystallin)的積聚密切相關(guān)。關(guān)于硅油的副作用已有文獻(xiàn)報(bào)道，2001年劉宇英等[10]研究了一次性注射器所用的硅油潤(rùn)滑劑對(duì)家兔肺組織的損傷，結(jié)果表明注射大劑量硅油微粒時(shí)對(duì)肺組織有病理?yè)p傷。據(jù)分析，損傷源于硅油導(dǎo)致的血栓和油栓。2005年Jones等[11]探討了注射器、瓶塞等容器表面的硅油對(duì)蛋白類藥物的污染。通過研究核糖核酸酶A、溶菌酶、牛血清白蛋白和刀豆素A這4種模式蛋白與硅油的相互作用，發(fā)現(xiàn)它們?cè)?.5%的硅油水溶液中，有明顯的“aggregation”。文中雖然用了aggregation一詞，但是實(shí)質(zhì)是講蛋白的團(tuán)簇和堆積，與淀粉樣纖維是不一樣的。

本文通過研究硅油對(duì)AcP11肽、a-突觸核蛋白(a-Syn)、淀粉樣蛋白b1-42(Human Ab42)、Ure2蛋白和GAV9肽的影響，發(fā)現(xiàn)硅油可以促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白和多肽的積聚。這5種材料依次介紹如下：AcP11是一種11肽，序列為CH3CO-QQRFQWQFEQQ-CONH2，由Aggeli等[12]設(shè)計(jì)，可通過形成b-sheet結(jié)構(gòu)的方式組裝聚集；a-Syn是帕金森癥相關(guān)蛋白；Human Ab42是阿茨海默癥相關(guān)蛋白；Ure2是酵母類Prion蛋白；GAV9是一種9肽，序列為NH2-VGGAVVAGV-CONH2，類似于a-Syn的66-VGGAVVTGV-74、Ab的36-VGGVVIATV-44和Prion蛋白的117- AAGAVVGGL-125，這三段序列都是其對(duì)應(yīng)蛋白的核心疏水區(qū)段。關(guān)于GAV9在不同界面的組裝行為，已經(jīng)有了較多研究[13-17]。

1 材料和方法

1.1 材料

硅油為道康寧公司184灌封膠(Sylgard? 184 Silicone Elastomer)的主體部分；AcP11肽(CH3CO-QQRFQWQFEQQ-CONH2)購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；a-Syn和Ure2蛋白取自中國(guó)科學(xué)院生物與化學(xué)交叉中心(Interdisciplinary Research Center of Biology and Chemistry, IRCBC)劉聰老師實(shí)驗(yàn)室；Ab42購(gòu)自北京博勝經(jīng)緯科技有限公司，GAV9肽(NH2-VGGAVVAGV-CONH2)購(gòu)自上海多肽生物技術(shù)有限公司；配制緩沖液的磷酸鹽和氯化鈉等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；實(shí)驗(yàn)用水使用ELGA公司PURELAB Classic超純水儀制備的超純水（電阻率為18.2 MW·cm）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)器材清洗

為清除實(shí)驗(yàn)體系中的硅油本底，實(shí)驗(yàn)過程中所要用到的96孔板、Eppendorf 離心管、槍頭、配制Buffer的玻璃瓶等，都用乙醇浸泡兩天以上，浸泡完后，反復(fù)用乙醇超聲清洗；然后用超純水超聲清洗3次；最后置于烘箱中70°C靜置烘干。

1.2.2 粉末樣品溶解

實(shí)驗(yàn)所用的AcP11肽、Ab42、GAV9肽，購(gòu)買時(shí)為粉末狀態(tài)，需要溶解；a-Syn和Ure2蛋白取得時(shí)即為溶液，不需溶解。AcP11肽用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)（10 mmol·L?1磷酸鹽，20 mmol·L?1NaCl，pH=7.20）配制成飽和溶液，充分混勻后，14 000 r·min?1離心10 min，取上清液，凍存于?20°C待用。Ab42用PBS（10 mmol·L?1磷酸鹽，20 mmol·L?1NaCl，pH=7.88）配制成4mg·mL?1和2mg·mL?1的原液，充分混勻后，8000r·min?1離心5min，取上清液，凍存于?20°C待用。GAV9肽用超純水配制成飽和溶液，充分混勻后，10000 r·min?1離心10 min，取上清液，凍存于?20°C待用。a-Syn使用的緩沖液為25 mmol·L?1Tris，0.1 mol·L?1NaCl，pH 7.40；Ure2使用的緩沖液為50 mmol·L?1Tris，0.2 mol·L?1NaCl，pH 8.40。

1.2.3 硅油水溶液和震蕩水的制備

硅油水溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。取100mL 硅油至15 mL 離心管中，加入9.9 mL 緩沖液（在不同的樣品體系中，使用相對(duì)應(yīng)的緩沖液），震蕩，超聲30 min，得到硅油乳濁液；然后5 000 r·min?1離心3 min，取上清液使用。

在15 mL塑料離心管中加入8 mL超純水，手動(dòng)搖動(dòng)并在渦旋混勻儀上混勻2 min即可。

1.2.4 酶標(biāo)儀測(cè)熒光

本實(shí)驗(yàn)采用硫磺素T(ThT)熒光分析法檢測(cè)b折疊的形成量，使用的ThT終濃度為20mmol·L?1。

使用美國(guó)Thermo Scientific公司的Fluoroskan Ascent熒光讀數(shù)儀進(jìn)行動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)測(cè)量。激發(fā)光波長(zhǎng)440 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)485 nm，培育溫度37°C，搖動(dòng)直徑為3 mm，轉(zhuǎn)速為240 r·min?1，每10 min測(cè)量一次，以此作出動(dòng)力學(xué)曲線。

發(fā)射譜掃描曲線，使用BioTek? Synergy H Hybrid Reader儀器。激發(fā)光波長(zhǎng)440nm，掃描470–570nm或470–600nm范圍內(nèi)的發(fā)射強(qiáng)度，以此做出掃描曲線。

1.2.5 原子力顯微鏡檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)中所使用的原子力顯微鏡為布魯克Multimode 8 型儀器，成像模式為PeakForce QNM in Air。襯底為白云母和高序熱解石墨。用酶標(biāo)儀檢測(cè)后的樣品進(jìn)行測(cè)試，取3–5mL于襯底上，靜置 3 min，洗耳球吹干，再滴加60mL 超純水清洗，隨即吹干，成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 AcP11肽的熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 AcP11肽的半飽和溶液在不同硅油濃度的體系中的積聚曲線

多肽飽和液與不同配液分別等體積混合，96孔板每孔加樣200mL，5個(gè)平行孔。終溶液中，硅油濃度梯度為硅油飽和濃度的1/2、1/100、1/1 000和0（不含硅油），設(shè)置不含硅油和含硅油的Buffer+ThT空白為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，其中1/2表示硅油濃度為飽和濃度的二分之一，1/100表示硅油濃度為飽和濃度的百分之一，1/1000相應(yīng)的表示千分之一；0表示體系中不含硅油；1/2C表示在不含多肽的Buffer+ThT空白對(duì)照組體系中，有半飽和的硅油，0C表示不含硅油的空白對(duì)照。

圖1 AcP11肽的半飽和溶液在不同硅油濃度的體系中的積聚曲線

從圖1中可明顯看出，在含有硅油的體系中，ThT熒光強(qiáng)度曲線上升起點(diǎn)早，平臺(tái)期熒光強(qiáng)度較不含硅油組相比增高；而且隨著硅油濃度的增加，促進(jìn)效果逐漸增強(qiáng)。另外，空白對(duì)照組0C和1/2C中，硅油的存在與否不影響熒光強(qiáng)度，都保持在很低的水平。

2.1.2 AcP11肽的半半飽和溶液在不同硅油濃度的體系中的積聚曲線

濃度為1/2飽和濃度的AcP11肽溶液，與不同配液分別等體積混合，每孔加樣200mL，3孔平行樣。終液中，肽濃度為飽和濃度的1/4，硅油濃度梯度有1/2、1/100、0，如圖2。

圖2 AcP11肽的半半飽和溶液在不同硅油濃度的體系中的積聚曲線

這里AcP11的積聚有明顯的階段性，有兩次上升過程，第二次更顯著。整個(gè)過程分為三步總結(jié)。

圖2(a)：0–12 h的初期范圍內(nèi)，在含有硅油的體系中，熒光強(qiáng)度曲線更早開始上升，平臺(tái)期的位置也更高；隨著硅油濃度的增加，促進(jìn)效果更顯著。

圖2(b)：0–40 h的中期范圍內(nèi)，在硅油濃度最高的體系中，AcP11的熒光曲線在第一次平臺(tái)的基礎(chǔ)上，又跨越到一個(gè)更高的平臺(tái)位置；而硅油濃度較低的體系和不含硅油的體系，曲線依舊維持在第一次平臺(tái)的位置。

圖2(c)：0–200 h的長(zhǎng)期范圍內(nèi)，這次圖中每條線代表一個(gè)孔的數(shù)據(jù)，沒有統(tǒng)計(jì)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，因?yàn)榘俜种伙柡凸栌蜐舛鹊捏w系各個(gè)平行樣分期出現(xiàn)第二次上升，如圖中五角星標(biāo)志的曲線。到此時(shí)，含有硅油的體系都陸續(xù)跨越到更高的平臺(tái)（高度為第一次平臺(tái)的15倍），不含硅油的組卻呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。

由圖1、圖2得出，硅油對(duì)AcP11積聚的促進(jìn)在速度和程度上都是隨著硅油濃度而增強(qiáng)。

2.2 a-Syn、Ab42、Ure2在不同硅油濃度的體系中的積聚曲線

a-Syn終濃度約3.25 mg·mL?1，結(jié)果如圖3(a)。Ure2終濃度為26mmol·mL?1，結(jié)果如圖3(b)。Ab42終濃度約1 mg·mL?1時(shí)，結(jié)果如圖3(c)。Ab42終濃度約2 mg·mL?1時(shí)，結(jié)果如圖3(d)。

圖3(a)中顯示，a-Syn在含1/1 000飽和濃度硅油的體系中，比不含硅油體系的熒光強(qiáng)度更早開始上升，平臺(tái)期也更高；含1/2飽和濃度硅油的體系，雖然熒光強(qiáng)度上升起點(diǎn)比不含硅油的晚一些，但是平臺(tái)位置卻高出近兩倍，這種情況是纖維更多累積的反映，也是促進(jìn)淀粉樣纖維積聚的結(jié)果。需要說明的是，圖3中曲線的標(biāo)準(zhǔn)差比較大，這是由于平行孔之間的差異本身就偏大。通常a-Syn蛋白在進(jìn)行動(dòng)力學(xué)曲線實(shí)驗(yàn)時(shí)，都是平行組內(nèi)波動(dòng)較大，這是這種蛋白的特殊性，機(jī)制尚不清楚。盡管平行樣的一致性差，但是總體趨勢(shì)仍然較為明顯。

圖3(b)中顯示，Ure2在含1/2和1/4飽和濃度硅油的體系中，曲線同步上升，并穩(wěn)定在更高的平臺(tái)期。硅油對(duì)Ure2蛋白積聚的促進(jìn)作用是一致的。

圖3(c)中顯示，1 mg·mL?1Ab42在含硅油的體系中，熒光強(qiáng)度曲線更早地開始上升，硅油加速Ab42的積聚。圖3(d)中顯示，2 mg·mL?1Ab42在含硅油的體系中經(jīng)歷了兩次上升，最終的平臺(tái)位置高于不含硅油的體系。硅油對(duì)不同濃度的Ab42的促進(jìn)方式可能有所不同。

由圖3得出，硅油對(duì)這三種蛋白的積聚都有促進(jìn)作用。

圖3 a-Syn (a)、Ure2 (b)、Ab42 (c, d)在不同硅油濃度的體系中的積聚曲線

2.3 渦旋操作導(dǎo)致的硅油污染實(shí)驗(yàn)

在15 mL離心管的加工過程中，使用了硅油進(jìn)行表面處理，離心管使用時(shí)會(huì)有部分硅油脫落下來(lái)，混入到溶液里造成硅油污染。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們探究渦旋操作是否會(huì)對(duì)GAV9肽的積聚造成影響。

在15 mL塑料離心管中加入8 mL超純水，手動(dòng)搖動(dòng)并在渦旋混勻儀上混勻2 min，取離心管中水與GAV9飽和液等體積混合，并加入ThT測(cè)熒光強(qiáng)度。同時(shí)使用新制的超純水與GAV9飽和液等體積混合作為對(duì)照組。設(shè)置激發(fā)光波長(zhǎng)為440 nm，每測(cè)完一次后，取出96孔板，室溫避光靜置。分別在不同時(shí)間測(cè)量，結(jié)果總結(jié)于圖4(a)中。

GAV9肽在有/無(wú)硅油的體系中的積聚性質(zhì)比較：用超純水溶解多肽和硅油，多肽終濃度是飽和濃度的一半。設(shè)置激發(fā)光波長(zhǎng)為440 nm，每測(cè)完一次后，取出96孔板，室溫避光靜置。分別在不同時(shí)間測(cè)量，結(jié)果總結(jié)于圖4(b)中。

圖4 GAV9肽在渦旋水/新制水體系(a)和有/無(wú)硅油體系(b)中的積聚性質(zhì)

圖4(a)中顯示，經(jīng)渦旋操作的GAV9溶液中ThT熒光隨著時(shí)間推移，強(qiáng)度顯著上升；而新制水體系中的ThT熒光強(qiáng)度線一直停留在較低水平，可能有微弱積聚。

圖4(b)中顯示，含硅油體系中的ThT 熒光隨著時(shí)間推移，強(qiáng)度顯著上升；而無(wú)硅油體系中的ThT熒光強(qiáng)度一直停留在較低水平，可能有微弱積聚。

圖4(a)的結(jié)果可能是因?yàn)?5 mL離心管內(nèi)壁的硅油由于渦旋操作而脫落，混入溶液中，從而促進(jìn)GAV9肽積聚。

由圖4得出，硅油能顯著促進(jìn)GAV9的積聚，并且渦旋操作可以造成硅油污染。

2.4 a-Syn的原子力顯微鏡表征

樣品取自圖3(a)中1/2飽和濃度硅油組和不含硅油組，襯底為云母，結(jié)果如圖5。

圖5 在硅油體系(a)和無(wú)硅油體系(b)中積聚的a-Syn纖維的原子力顯微鏡圖像

圖5顯示，含硅油體系(圖5(a))的纖維總量增多，長(zhǎng)度增長(zhǎng)，而且纖維與纖維之間的堆積大量增加；與圖3(a)中含硅油體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的結(jié)果一致，表明硅油有助于a-Syn蛋白的積聚。

2.5 Ab42的原子力顯微鏡表征

樣品取自圖3(d)中1/2飽和濃度硅油組和不含硅油組，襯底為云母，結(jié)果如圖6。

圖6 在硅油體系(a)和無(wú)硅油體系(b)中積聚的Ab42纖維的原子力顯微鏡圖像

圖6顯示，含硅油體系(圖6(a))的纖維總量顯著增多，纖維之間的堆積明顯密實(shí)；與圖3(d)中含硅油體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的結(jié)果一致，表明硅油有助于a-Syn蛋白的積聚。

2.6 AcP11的原子力顯微鏡表征

如圖7所示，樣品取自圖1中1/100飽和濃度硅油組，襯底為高定向熱解石墨(Highly Oriented Pyrolytic Graphite, HOPG)。

圖7 AcP11的原子力顯微鏡表征

在AcP11的多個(gè)樣品中，在云母和HOPG上，均未發(fā)現(xiàn)類似于a-Syn和Ab42的纖維。在HOPG上出現(xiàn)圖7(a)的結(jié)構(gòu)，其高度如圖7(b)所示在1.20 nm附近。有可能AcP11的聚集形態(tài)不同于通常纖維。

3 結(jié)語(yǔ)

硅油能促進(jìn)AcP11、a-Syn、Ure2、Ab42和GAV9 這5種淀粉樣樣品的積聚。

硅油幫助淀粉樣蛋白和多肽積聚的原因可能是由于硅油的疏水表面能富集有疏水部位的蛋白和多肽，使得局部濃度增大，利于蛋白和多肽的積聚。細(xì)節(jié)過程可采用“成核–延伸”的模型來(lái)闡述，分為成核階段的作用和延伸階段的作用：(1) 成核需要初始蛋白或多肽在不斷的構(gòu)象變化中，能經(jīng)歷并可穩(wěn)定在適合組裝成纖維的構(gòu)象狀態(tài)，硅油表面的疏水界面可以有助于蛋白和多肽暴露其疏水面，有利于形成適合組裝的構(gòu)象，并且易于穩(wěn)定于該構(gòu)象；此外，某蛋白在接近于成纖維構(gòu)象時(shí)，如果附近有類似蛋白存在，那么它們可能會(huì)相互促進(jìn)對(duì)方進(jìn)入成纖維構(gòu)象，并結(jié)合起來(lái)形成晶核，而硅油表面可以提供這樣的條件，富集蛋白并且輔助蛋白趨向于成纖維構(gòu)象。(2) 延伸階段中，疏水界面能富集蛋白，使得晶核延伸的速率大大增加；此外，如果硅油微粒和纖維側(cè)面靠在一起，可能有利于纖維本身的穩(wěn)定；在活性末端，隨著纖維延伸，如果總能有硅油微?？拷┒?，在末端營(yíng)造疏水氛圍，則可持續(xù)促進(jìn)游離蛋白調(diào)整構(gòu)象加入到纖維中來(lái)。(3) 硅油微粒還可以富集纖維，使得纖維聚集在一起，形成較大范圍的疏水域，利于組裝行為的維持和發(fā)展。

需要提到的是，疏水物既可能促進(jìn)積聚，也可能抑制積聚。抑制行為可能會(huì)發(fā)生在當(dāng)硅油結(jié)合到活性疏水部位，擋住了游離蛋白時(shí)。實(shí)驗(yàn)所觀察到的現(xiàn)象，是所有因素綜合作用的最終結(jié)果。在本文實(shí)驗(yàn)中，最終綜合的效應(yīng)是硅油促進(jìn)了淀粉樣蛋白和多肽的積聚。

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15 Li H, Zhang F, Zhang Y,. Peptide diffusion and self-assembly in ambient water nanofilm on Mica surface[J]. The Journal of Physical Chemistry B, 2009, 113(26): 8795–8789. DOI: 10.1021/jp903446g

16 Li H, Zhang F, Zhang Y,. Organic solvents mediate self-assembly of GAV-9 peptide on Mica surface[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2007, 39(4): 285–289

17 Zhang F C, Zhang F, Su H N,. Nanomanipulation- assisted self-assembly to achieve defect repair and guided epitaxial growth of individual peptide nanofilaments[J]. ACS Nano, 2010, 4(10): 5791–5796. DOI: 10.1021/ nn101541m

Silicone oil promotes the aggregation of amyloid proteins and peptides

LI Jia1LEI Haozhi1DAI Bin2QI Qige1ZHANG Yi1HU Jun1

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Background: The aggregation of amyloid proteins leads to some serious diseases, such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease; silicone oil is identified as biosafety material, and is widely used in industry and daily life, even implantation. Purpose: The aim is to study the influence of silicone oil on the aggregation of amyloid proteins and peptides. Methods: We measured the fluorescence of thioflavin T(ThT) in the samples and image the aggregated fibers by atomic force microscope (AFM). Results: Five kinds of amyloid proteins/peptides aggregated faster and more sufficiently in the samples containing silicone oil, and the fibers are longer and denser in silicone oil sample. Conclusion: A certain amount of silicone oil can promote the aggregation of these amyloid proteins and peptides.

Silicone oil, Amyloid protein, Vibration, Aggregation

TL99

TL99

10.11889/j.0253-3219.2015.hjs.38.080501

國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃(No.2013CB932801)、國(guó)家自然科學(xué)基金(No.11274334)、中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目(No.KJZD-EW-M03)資助

李佳，男，1989年出生，2015年于中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所獲碩士學(xué)位

胡鈞，E-mail: hujun@sinap.ac.cn

2015-03-18，

2015-04-10