劉靜，翟婷婷，于曉倩，王海媛，任智慧，晉興華

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Box-Behnken法優(yōu)化不同孔徑MCM-41包載胡蘿卜素的處方工藝

劉靜，翟婷婷，于曉倩，王海媛，任智慧，晉興華

（天津大學藥物科學與技術(shù)學院，天津 300072）

采用三水平三因素的Box-Behnken實驗設計，利用響應曲面法對影響MCM-41包載胡蘿卜素包封率的主要因素進行研究，主要考慮的影響因素有載藥時間、擴孔劑含量、胡蘿卜素/MCM-41投藥比等，以MCM-41對胡蘿卜素的包封率作為評價因素，建立相應的數(shù)學模型，優(yōu)化處方。結(jié)果表明，最優(yōu)的處方工藝是載藥時間為20h、擴孔劑含量為0.6mL、胡蘿卜素/MCM-41投藥比為3。在此條件下，胡蘿卜素的包封率可達理論預測值的95.83%，說明將Box-Behnken實驗設計法用于MCM-41包載胡蘿卜素處方的優(yōu)化篩選是可行的，且得到的實驗觀察值與數(shù)學模型的預測值相符合。

MCM-41；胡蘿卜素；Box-Behnken實驗設計

胡蘿卜素是Wakenroer于20世紀30年代從胡蘿卜中發(fā)現(xiàn)的一種天然色素[1]。大量研究證實，胡蘿卜素的生理活性已被越來越多地證實并應用于疾病的預防和治療。胡蘿卜素是維生素A的主要來源[2]，它具有清除自由基和高效淬滅單線態(tài)氧的作用，具有很強的抗氧化性，且對人體免疫系統(tǒng)有增強作用。但是，胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)中含有多個雙鍵，具有化學不穩(wěn)定性，氧氣、光輻射、酸、堿、高溫、水分等都是影響其穩(wěn)定性的因素。并且胡蘿卜素不溶于水，微溶于油，使得其生物利用度很低，大大限制了其應用[3-6]。因此尋找增加其溶解性和穩(wěn)定性的包載材料非常重要。由于介孔分子篩材料MCM-41具有比表面積大、無毒副作用、生物兼容性良好等特點[7-9]，故本實驗考慮采用MCM-41來包載胡蘿卜素以增加其生物利用度。但目前尚未有利用介孔分子篩MCM-41對脂溶性色素胡蘿卜素進行包載的研究。

響應曲面法（response surface methodology，RSM）是現(xiàn)代統(tǒng)計與數(shù)學的集成方法，被廣泛應用于響應變量與自變量函數(shù)關(guān)系研究中[10]。響應曲面分析法采用多元二次回歸方程擬合各因素與響應值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析以尋求最佳工藝參數(shù)，解決多變量的一種統(tǒng)計方法。Box-Behnken 實驗設計（BBD）是RSM中常用的實驗設計方法之一。BBD是一種基于三水平的二階實驗設計法，其所有試驗點均落在安全操作范圍之內(nèi)，試驗次數(shù)相對較少，效率更高。故本實驗采用Box-Behnken設計來優(yōu)化不同孔徑的MCM-41包載胡蘿卜素的處方工藝。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑：胡蘿卜素，純度>82%，天津光復精細化工研究所；正硅酸乙酯（TEOS），分析純，天津市博迪化工有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），分析純，天津光復精細化工研究所；NaOH，分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司；超純水，Milli-Q Academic；甲醇，色譜純，天津康科德科技有限公司；氯仿、丙酮、無水乙醇等均為分析純。

儀器：Agilent Cary 60紫外分光光度計；Agilent 1200高效液相色譜儀；Anke TGL-16G高速臺式離心機；KE-BEI型電熱恒溫水浴鍋；Mettler toledo XS105型電子天平；SX2-4-10馬弗爐，天津天有利科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同孔徑MCM-41的制備

制備不同孔徑MCM-41的各原料的摩爾比為：CTAB∶TMB∶7.564 TEOS∶2.551 NaOH∶4652 H2O (/= 1，2，3)。具體制備過程如下：用量筒量取360mL超純水置于500mL三口瓶中，加熱到80℃后，在攪拌的條件下向三口瓶中加入1.5g CTAB，攪拌均勻后加入5.25mL 2mol/L NaOH溶液，攪拌反應3min，溶液呈均相后，向三口瓶中加入適量擴孔劑1,3,5-三甲基苯（TMB），并緩慢加入7.5mL TEOS，保持80℃溫度下不斷攪拌反應2h。反應后溶液冷卻至室溫，抽濾泵進行抽濾，并分別用水和無水乙醇洗滌3次，65℃下過夜干燥。將得到的MCM-41放入馬弗爐中，550℃下煅燒5h，得到不同孔徑的MCM-41。根據(jù)加入的擴孔劑的量不同，得到的MCM-41分別記作M1、M2、M3。

1.2.2 β-胡蘿卜素的組裝

胡蘿卜素的組裝采用溶劑浸漬法。分別稱取0.5g M1、M2、M3不同孔徑的介孔分子篩，加入到一定濃度的胡蘿卜素的氯仿/丙酮（體積比9∶1）溶液中，密封，避光，放入37℃恒溫震蕩器中震蕩一定時間后，10000r/min離心3min，取上清液，用紫外分光光度法測定胡蘿卜素的包封率，胡蘿卜素的最大吸收波長為445nm。根據(jù)式（1）測定胡蘿卜素的包封率。

=×100% （1）

式中，為胡蘿卜素的包封率；總為加入的胡蘿卜素的總質(zhì)量；游離為離心后上清液中剩余的胡蘿卜素的質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 MCM-41的表征

2.1.1 FT-IR譜圖

圖1為合成的不同孔徑的介孔分子篩M1、M2、M3在去除模板后的傅里葉變換紅外光譜圖，波數(shù)區(qū)間為400～4000cm?1。在圖譜上，950cm?1處的特征吸收峰體現(xiàn)了端基硅羥基的對稱伸縮振動；與硅骨架有關(guān)的譜峰出現(xiàn)在1096cm?1和810cm?1兩處，分別為硅氧鍵Si—O—Si不對稱與對稱伸縮振動；460cm?1處的譜峰為Si—O鍵的彎曲振動。從以上分析可知，加入擴孔劑后得到的不同孔徑的介孔分子篩仍保持良好的介孔孔道結(jié)構(gòu)。

2.1.2 TEM

圖2是合成的不同孔徑的介孔分子篩M1、M2、M3的透射電鏡照片，可以看出，加入擴孔劑后合成的介孔分子篩顆粒形狀規(guī)整，大小均勻，晶粒尺寸約為200nm，球形度良好。圖2(d)為M2的高倍透射電鏡照片，圖中可以清晰地看到介孔分子篩規(guī)整的孔道結(jié)構(gòu)。

2.1.3 N2吸附-解吸附

從圖3可知，制備的不同孔徑的介孔分子篩的N2吸附-解吸附等溫線均屬于Ⅳ型等溫線，是介孔材料典型的吸附等溫線。對比圖3 中M1、M2、M3可以發(fā)現(xiàn)，加入擴孔劑后得到的介孔分子篩的3條等溫線均出現(xiàn)了一個滯后環(huán)，這說明擴孔劑的加入并沒有改變材料的孔道結(jié)構(gòu)，材料均具有圓柱形細長孔道結(jié)構(gòu)。與透射電鏡的分析結(jié)果相互印證。且隨著加入擴孔劑的含量的不同，介孔材料的氮氣吸附量有少量增加，這是因為加入的致孔劑使材料的孔容增大，因而進入孔道的氮氣量會有所增加。

從表1中可以看出，MCM-41的比表面積均比較大，在1000m2/g左右。介孔材料的孔徑在2～10nm，并且隨著擴孔劑的加入量逐漸增大，制備的介孔分子篩的孔徑逐漸增大、孔容積增加、比表面積逐漸減小。

表1 介孔材料結(jié)構(gòu)參數(shù)

2.2 浸漬溶劑的選擇

考察了4種常見的浸漬溶劑[氯仿、丙酮、二氯甲烷以及氯仿-丙酮（體積比9∶1）]對于胡蘿卜素包封率的影響。設定胡蘿卜素-MCM-41（質(zhì)量比1∶1）于37℃恒溫震蕩器中震蕩24h，離心，吸取上清液，測定胡蘿卜素的包封率，結(jié)果見圖4。浸漬溶劑篩選的原則主要是在對胡蘿卜素有一定溶解度的基礎上，恰當?shù)娜軇┙殡姵?shù)能夠增加溶劑在介孔分子篩中的滲透性，因此篩選出合適的 介電常數(shù)的溶劑有利于提高胡蘿卜素的包封 率[11-12]。由圖4分析可知，當單獨采用丙酮作為浸漬溶劑時，雖然丙酮的極性較大，但對胡蘿卜素的溶解度較低，故胡蘿卜素的包封率低；當單獨采用二氯甲烷作為浸漬溶劑時，雖然二氯甲烷的極性比較適中，但是胡蘿卜素在二氯甲烷中的溶解度大，胡蘿卜素與二氯甲烷的相互作用較強，使得其很難在介孔分子篩與溶劑之間達到分配平衡，胡蘿卜素的包封率較低；當單獨采用三氯甲烷作為溶劑時，由于其溶解性適中，只是極性略小，得到的胡蘿卜素的包封率已經(jīng)有較大程度的提高，但為了進一步提高三氯甲烷作為浸漬溶劑時胡蘿卜素的包封率，選擇采用混合溶劑，將三氯甲烷與丙酮按照9∶1的比例混合，在盡可能保持胡蘿卜素在混合溶劑中的溶解度的前提下，改善三氯甲烷的極性，提高胡蘿卜素的包封率。

2.3 單因素試驗

2.3.1 載藥時間的影響

在胡蘿卜素-MCM-41（1∶1）、浸漬溶劑為氯仿-丙酮（體積比9∶1）的條件下，考察了不同的載藥時間對于胡蘿卜素包封率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，當載藥時間在16h左右時，曲線發(fā)生突躍，這可能是由于MCM-41的介孔孔徑與胡蘿卜素分子之間的吸附-解吸附過程達到平衡，胡蘿卜素分子開始進入到介孔孔道內(nèi)，故當載藥時間>16h時，胡蘿卜素的包封率逐漸增加，24h以后，胡蘿卜素的包封率略有降低，可能的原因是介孔孔道是開放性孔道，載藥時間過長會導致胡蘿卜素的泄漏。故載藥時間應控制在16～24h。

2.3.2 β-胡蘿卜素與MCM-41質(zhì)量比的影響

在浸漬溶劑為氯仿-丙酮（9∶1）、載藥時間為20h的條件下，考察了胡蘿卜素與MCM-41質(zhì)量比對胡蘿卜素包封率的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，隨著胡蘿卜素與MCM-41質(zhì)量比的增加，胡蘿卜素的包封率逐漸增加，這是由于當增加胡蘿卜素與MCM-41質(zhì)量比時，介孔孔道內(nèi)外的胡蘿卜素的濃度差逐漸增大，則進入到介孔孔道中的胡蘿卜素也隨之增加。然而，胡蘿卜素的濃度越大，由于MCM-41巨大的比表面積，胡蘿卜素會吸附于MCM-41的表面而未能進入到介孔孔道中，則會造成測定的胡蘿卜素的包封率不準確。

2.3.3 擴孔劑含量的影響

在浸漬溶劑為氯仿-丙酮（9∶1）、載藥時間為20h的條件下，考察了加入不同量的1,3,5-TMB對胡蘿卜素包封率的影響。

由圖7所示，當加入的擴孔劑的用量逐漸增加，胡蘿卜素的包封率隨之增加，但當擴孔劑的用量到達一定值后，則胡蘿卜素的包封率基本不再發(fā)生改變。這是由于當增加擴孔劑用量時，MCM-41的孔徑增大，能夠容納的胡蘿卜素分子就越多，但1,3,5-TMB的擴孔能力是有限的，過量的擴孔劑會使MCM-41的結(jié)晶有序度下降，故擴孔劑只能夠使胡蘿卜素的包封率在一定范圍內(nèi)增加。

2.4 實驗設計

實驗采用Design-Experts 8.0.6軟件中的Box-Behnken 實驗設計，在單因素考察的基礎上，選取對胡蘿卜素的包封率影響較為顯著的3個因素，即擴孔劑含量() ，胡蘿卜素與MCM-41的質(zhì)量比()以及載藥時間()，在3個水平上進行了研究，以胡蘿卜素的包封率作為響應值，進行3因素3水平的響應曲面實驗（表2）。

表2 Box-Behnken設計的因素與水平

（1）二次回歸模型的建立 實驗結(jié)果見表3。利用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗結(jié)果進行響應曲面分析，求得回歸方程為：=52.72?1.67+ 30.12+1.87?1.01?2.84?0.11?6.242+4.142?2.112。

表3 Box-Behnken實驗設計結(jié)果

（2）方差分析和顯著性檢驗 回歸方程的各項方差分析結(jié)果見表4。擬合的一元二次方程的相關(guān)系數(shù)2= 0.9957。值為206.74，0.05>值（<0.0001），顯著性檢驗表明，該回歸方差達到極顯著水平。而失擬項=1.52，明顯小于3,2=19.2，說明模型的擬合度良好，可以用此模型來對MCM-41包載胡蘿卜素的處方進行分析及預測。方程中的一次項對胡蘿卜素包封率的影響達到了較為顯著的水平，二次項對胡蘿卜素包封率的影響則表現(xiàn)的更為顯著，交互項中只有的交互作用對于胡蘿卜素包封率的影響有顯著影響，這均說明自變量與響應值之間并不能用簡單的線性關(guān)系來表述。

表4 回歸方程各項的方差分析

（3）響應曲面分析 通過模型方程得到響應曲面圖和等高線圖，結(jié)果見圖8～圖10。胡蘿卜素- MCM-41的質(zhì)量比對胡蘿卜素的包封率影響十分顯著，并且擴孔劑的含量與載藥時間的交互作用對胡蘿卜素的包封率影響最為顯著。

由圖8～圖10分析可知，利用不同孔徑MCM-41包載胡蘿卜素的最佳條件為載藥時間為20.66h、擴孔劑用量為0.6mL、胡蘿卜素/MCM-41為2.96。在該條件下，胡蘿卜素的包封率可達到85.85%。

2.5 驗證實驗

在得到的最佳包載條件下，重復3次實驗來比較實驗值與預測值的吻合度，結(jié)果見表5。由表5可知，吻合度可達95.83%，證明了回歸模型的可行性。因此采用響應曲面法優(yōu)化得到的MCM-41包載胡蘿卜素的參數(shù)基本準確可靠，具有一定的實用價值。

表5 驗證實驗結(jié)果

3 結(jié) 論

首次利用介孔二氧化硅微球作為載體包載胡蘿卜素，并結(jié)合響應曲面法對該處方工藝進行了優(yōu)化，獲得了良好的結(jié)果。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，當利用不同孔徑的MCM-41對胡蘿卜素進行包載時，擴孔劑的含量與載藥時間的交互作用對于胡蘿卜素的包封率具有顯著的影響。最佳的包載條件為：載藥時間為20.66h，擴孔劑含量為0.6mL，胡蘿卜素/MCM-41為2.96。在該條件下，胡蘿卜素的包封率可達理論預測值的95.83%。利用介孔二氧化硅微球作為載體包載胡蘿卜素可以為胡蘿卜素的新劑型研究提供新的實驗依據(jù)。

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Optimization ofcarotene loaded MCM-41 mesoporous silica by Box-Behnken design

LIU Jing，ZHAI Tingting，YU Xiaoqian，WANG Haiyuan，REN Zhihui，JIN Xinghua

（School of Pharmaceutical Science and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

To optimize the formulation parameters of beta-carotene loaded MCM-41 mesoporous silica for the maximum encapsulation efficiency，experiments were designed according to a three-level，three-variable Box-Behnken design (BBD). Independent variables were the amount of pore enlarging agent ()，the beta-carotene/MCM-41 mass ratio ()，and loading time ()，and the response variable was the encapsulated efficiency of beta-carotene (EE). The optimal formulation parameters were as follows：，andlevels were 0.6mL，3 and 20h，respectively. The observed responses agree with the predicted values of the mathematic models，and the Box-Behnken design is suitable for optimizing the formulation of beta-carotene loaded MCM-41 mesoporous silica.

MCM-41；carotene；Box-Behnken design

R 914.2

A

1000–6613（2015）09–3392–07

10.16085/j.issn.1000-6613.2015.09.030

2015-01-09；修改稿日期：2015-02-06。

劉靜（1990—），女，碩士研究生。聯(lián)系人：晉興華，博士，講師。E-mail snail9006@163.com。