樊琛 李燕 曾慶華 王會(huì) 陸長(zhǎng)民 鄭煥芹

摘要：通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探討了FeS04溶液用量、水楊酸-乙醇溶液用量、H202溶液濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)Fenton反應(yīng)體系的影響，篩選出羥自由基反應(yīng)體系的最優(yōu)反應(yīng)條件，并檢測(cè)了乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH對(duì)反應(yīng)體系的影響。結(jié)果表明，最佳反應(yīng)條件為1.8 mmol/L的FeS04溶液2.50 mL，1.8 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液2.00 mL，0.05% H202溶液0.10 mL，蒸餾水0.50 mL，20 ℃水浴10 min。反應(yīng)體系的pH及待測(cè)液乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)反應(yīng)體系有明顯影響，建議待測(cè)液含乙醇時(shí)，應(yīng)做相同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)照組進(jìn)行修正。

關(guān)鍵詞：Fenton反應(yīng)；羥自由基；分光光度法；水楊酸

中圖分類(lèi)號(hào)：S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）21-5382-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.046

Correction of Fenton Hydroxy Radical Reaction System

FAN Chen， LI Yan， ZENG Qing-hua， WANG Hui， LU Chang-min， ZHENG Huan-qin

（College of Agricultural， Liaocheng University， Liaocheng 252059， Shandong， China）

Abstract：Through single factor experiment and orthogonal experiment were conducted to study the effects of FeS04 solution dosage， salicylic acid-ethanol dosage，H202 concentration， temperature， time of reaction system， screening out the optimum reaction conditions of hydroxyl free radical reaction system， and 1.8 mmol/L FeS04 solution for 2.50 mL，1.8 mmol/L of salicylic acid-ethanol solution 2.00 mL， 0.05% H202 solution 0.10 mL，0.50 mL of distilled water， in 20 ℃ water bath for 10 min. In addition， the effects of volume fraction of ethanol solution and the pH were also discussed. The results showed that pH and ethanol had obvious effects on the reaction system. The Control group should add ethanol with same concentration of experimental group.

Key words： Fenton reaction； hydroxyl radicals； spectrophotometric method； salicylic acid

羥自由基（·OH）消除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標(biāo)[1-3]。在幾種常用的羥自由基（·OH）檢測(cè)方法中，分光光度法較高效液相色譜法和電子自旋共振法簡(jiǎn)便、直接，且由于其所需設(shè)備簡(jiǎn)單，而被廣泛采用[4-8]。目前，常采用的方法是基于水楊酸可以捕獲羥自由基（·OH）生成2，3-二羥基苯甲酸和2，5-二羥基苯甲酸，在波長(zhǎng)510 nm處有最大吸收的原理，建立的用分光光度法檢測(cè)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基（·OH）的方法[9]。但是·OH的化學(xué)反應(yīng)活性強(qiáng)、存在壽命短[10，11]，實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中易引起明顯誤差。

本試驗(yàn)以FeS04、H2O2、水楊酸-乙醇為反應(yīng)體系，通過(guò)對(duì)影響反應(yīng)體系的條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選最佳反應(yīng)條件，并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，測(cè)定pH、乙醇等對(duì)羥自由基（·OH）反應(yīng)體系清除率的影響，為修正羥自由基檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

硫酸亞鐵、水楊酸、30%過(guò)氧化氫、無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、維生素C（抗壞血酸），所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；SB-2000型水浴鍋（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；T-214型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.3 反應(yīng)體系吸收光譜

取水楊酸-水溶液、水楊酸-乙醇-水溶液、水楊酸-乙醇溶液，在波長(zhǎng)190～1 100 nm范圍內(nèi)分別測(cè)定吸收光譜。

第一組：向各試管中依次加入3.00 mL蒸餾水，水楊酸-乙醇1.50 mL，最后加 H2O2 （0.03%）0.10 mL振蕩混合；第二組：向試管中依次加入1.00 mL蒸餾水，F(xiàn)eSO4溶液2.00 mL，水楊酸-乙醇1.50 mL，最后加 H2O2（0.03%） 0.10 mL，振蕩混合；第三組：向各試管中依次加入1.10 mL蒸餾水，F(xiàn)eSO4溶液2.00 mL，水楊酸-乙醇1.50 mL；第四組：水楊酸-乙醇，各組均在37 ℃水浴中40 min，在波長(zhǎng)190～1 100 nm處測(cè)定其吸光度，比較各組的吸收光譜圖。

水楊酸-水溶液、水楊酸-乙醇-水溶液吸收光譜檢測(cè)方法同上。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 FeS04用量的影響 改變FeSO4溶液的體積，其他反應(yīng)條件不變，考察FeSO4溶液不同用量對(duì)反應(yīng)體系吸光度的影響。向各試管中依次加入FeSO4溶液，分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，水楊酸-乙醇1.50 mL，蒸餾水補(bǔ)足體積至5.5 mL，最后加 H2O2（0.03%） 0.10 mL，振蕩混合，11 ℃條件下反應(yīng)10 min，在510 nm處測(cè)定其吸光度。

1.4.2 水楊酸-乙醇溶液用量的影響 取水楊酸-乙醇溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，其他條件不變，考察水楊酸-乙醇溶液不同用量對(duì)反應(yīng)體系吸光度的影響。

1.4.3 H2O2體積分?jǐn)?shù)的影響 加入不同體積分?jǐn)?shù)（0、0.010%、0.025%、0.035%、0.050%、0.100%、0.150%、0.200%、0.250%、0.300%、0.350%）的H2O2溶液0.10 mL啟動(dòng)反應(yīng)，其他條件不變，考察不同H2O2體積分?jǐn)?shù)對(duì)體系吸光度的影響。

1.4.4 反應(yīng)溫度的影響 在不同溫度條件下8、13、17、22、27、32、37、42、46 ℃反應(yīng)，其他條件不變，考察不同溫度對(duì)體系吸光度的影響。

1.4.5 反應(yīng)時(shí)間的影響 反應(yīng)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 min，其他條件不變，考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系吸光度的影響。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

上述單因素試驗(yàn)表明溫度和時(shí)間兩個(gè)因素對(duì)反應(yīng)體系的影響不明顯。因此，確定FeSO4溶液用量，水楊酸-乙醇溶液用量，H2O2溶液體積分?jǐn)?shù)為正交試驗(yàn)的三個(gè)因素，分別記作A、B、C，各因素均取3個(gè)水平，正交試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

1.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

1.6.1 動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)最優(yōu)組合，向試管中依次加入蒸餾水0.50 mL，F(xiàn)eSO4溶液2.50 mL，水楊酸-乙醇溶液2.00 mL，最后加入0.05%的H2O2溶液0.10 mL。加入H2O2溶液后立即（時(shí)間控制在15 s內(nèi)）倒入比色皿中，在510 nm處測(cè)定其吸光度，每隔5 s測(cè)一次。

1.6.2 乙醇的影響 在試管中依次加入FeSO4溶液2.50 mL，水楊酸-乙醇溶液2.00 mL，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液（0、30%、50%、70%）以及無(wú)水乙醇0.5 mL，H2O2（0.05%） 0.10 mL，振蕩混合，20 ℃水浴10 min，在510 nm下測(cè)量其吸光度。

1.6.3 pH的影響 在各試管中依次加入蒸餾水0.50 mL，F(xiàn)eSO4溶液2.50 mL，水楊酸-乙醇溶液2.00 mL，加H2O2（0.05%）0.10 mL，用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)各試管反應(yīng)體系的pH，分別為2.0、3.0、3.5、4.0、6.0、6.2、6.4、6.7、7.0，20 ℃水浴10 min，在510 nm下測(cè)量吸光度。

1.6.4 VC對(duì)羥自由基的清除作用 在試管中依次加入FeSO4溶液2.50 mL，水楊酸-乙醇溶液2.00 mL，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的VC溶液（0、50、100、150、200、300、400、500 μg/mL）0.5 mL，H202（0.05%） 0.10 mL，振蕩混合，20 ℃水浴10 min，在510 nm下測(cè)量吸光度。自由基清除率計(jì)算公式為：

D=[（AO-As）/AO]×100%

式中，AO為空白管的吸光度值，As為加入自由基清除劑后的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fenton反應(yīng)體系吸收光譜

Fenton反應(yīng)體系在510 nm波長(zhǎng)處有吸收峰，而水楊酸-乙醇溶液?jiǎn)为?dú)與FeSO4或者H2O2反應(yīng)時(shí)在510 nm波長(zhǎng)處沒(méi)有明顯的光吸收（圖1），說(shuō)明水楊酸溶液作為捕捉劑可捕捉Fenton試劑產(chǎn)生的羥自由基（·OH），產(chǎn)物在510 nm波長(zhǎng)有特征吸收峰，因此選用510 nm波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。

由圖1可見(jiàn)，吸收光譜b與a、c、d在510 nm波長(zhǎng)處有明顯差異，表明FeSO4溶液與H2O2溶液?jiǎn)为?dú)使用時(shí)幾乎不與水楊酸作用產(chǎn)生有色物質(zhì)，反應(yīng)體系產(chǎn)生的紫紅色物質(zhì)為羥自由基與水楊酸作用產(chǎn)生的。試驗(yàn)結(jié)果表明，水楊酸-乙醇溶液、水楊酸-水溶液、水楊酸-乙醇-水溶液，3種溶液的特征光吸收相近，由于水楊酸晶體易溶于乙醇，故反應(yīng)體系選用水楊酸-乙醇溶液。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 FeSO4用量的影響 如圖2所示，隨著FeSO4溶液用量的增大，反應(yīng)體系顏色逐漸加深，反應(yīng)體系的吸光度增大，當(dāng)FeSO4溶液用量增大到2.0 mL后，吸光度變化逐漸趨于平穩(wěn)，再增加FeSO4溶液的用量對(duì)反應(yīng)體系吸光度無(wú)明顯影響。

2.2.2 水楊酸-乙醇溶液用量的影響 隨著水楊酸-乙醇溶液用量增加，反應(yīng)體系顏色逐漸加深。 如圖3所示，隨著水楊酸-乙醇溶液用量的增加，反應(yīng)體系吸光度增大，當(dāng)水楊酸-乙醇溶液用量達(dá)到2.0 mL后，反應(yīng)體系吸光度趨于平穩(wěn)，再增加水楊酸-乙醇溶液的用量對(duì)反應(yīng)體系無(wú)明顯影響。

2.2.3 H2O2體積分?jǐn)?shù)的影響 隨著H2O2體積分?jǐn)?shù)的增加，反應(yīng)體系顏色逐漸加深。如圖4所示，隨H2O2溶液體積分?jǐn)?shù)的增大，吸光度隨之增大，H2O2溶液體積分?jǐn)?shù)在0～0.035%之間對(duì)反應(yīng)體系吸光度的影響明顯，當(dāng)H2O2溶液體積分?jǐn)?shù)大于0.035%后，吸光度趨于平穩(wěn)，再增大H2O2溶液的體積分?jǐn)?shù)對(duì)反應(yīng)體系無(wú)明顯影響。

2.2.4 反應(yīng)溫度的影響 隨著反應(yīng)溫度的變化，反應(yīng)體系顏色無(wú)明顯差異。如圖5所示，在17～22 ℃之間，反應(yīng)體系吸光度較高；反應(yīng)溫度大于22 ℃或小于17 ℃，反應(yīng)體系吸光度值降低，但降低的程度不明顯。

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間的影響 隨反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)，反應(yīng)體系顏色無(wú)明顯變化。如圖6所示，在反應(yīng)1 min時(shí)，其吸光度為0.849，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，反應(yīng)體系吸光度變化不明顯，表明反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系影響不明顯。

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)eSO4溶液用量，水楊酸-乙醇溶液用量和H2O2溶液體積分?jǐn)?shù)3個(gè)因素對(duì)反應(yīng)體系的影響明顯，而溫度和時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響不明顯。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

采用四因素三水平的正交試驗(yàn)方法，研究不同因素對(duì)Fenton反應(yīng)體系的影響，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，RC>RA>RB，各因素對(duì)Fenton反應(yīng)體系影響的主次順序?yàn)镃、A、B。即H2O2溶液的體積分?jǐn)?shù)影響最大，其次是FeSO4溶液的用量，而水楊酸-乙醇溶液用量的影響最小。A3B2C3為最優(yōu)組合，即：FeSO4溶液的用量為2.50 mL，水楊酸-乙醇溶液的用量為2.00 mL，H2O2溶液的體積分?jǐn)?shù)為0.05%，用量為0.10 mL，加水量為0.50 mL。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.4.1 動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 如圖7所示，反應(yīng)體系在最初75 s內(nèi)就產(chǎn)生了較多的羥自由基，在170 s時(shí)，吸光度達(dá)到1.003，此后吸光度值無(wú)明顯變化。

2.4.2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的影響 如圖8所示，不同體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、70%）的乙醇溶液以及無(wú)水乙醇對(duì)Fenton反應(yīng)體系有明顯影響。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，反應(yīng)體系吸光度值逐漸降低，表明乙醇可消除部分羥自由基。因此，實(shí)際應(yīng)用時(shí)，若待測(cè)液中含有乙醇，應(yīng)做相同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)照來(lái)修正待測(cè)液的羥基自由基清除率，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

2.4.3 pH的影響 如圖9所示，反應(yīng)體系pH 2.0～7.0時(shí)，其吸光度先升高后降低。pH小于4.0及大于6.4時(shí)反應(yīng)體系的吸光度值較小，當(dāng)體系pH大于7.0時(shí)，易產(chǎn)生沉淀。因此，反應(yīng)體系較合適的pH范圍為4.0～6.4，最適pH范圍為6.0～6.4。

2.4.4 維生素C對(duì)羥自由基的清除作用 維生素C溶液可顯著清除Fenton體系產(chǎn)生的羥自由基。由圖10可見(jiàn)，當(dāng)維生素C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到200 μg/mL時(shí)，反應(yīng)體系的羥自由基清除率可達(dá)100%。維生素C（抗壞血酸） 是一種有效的自由基清除劑，它通過(guò)逐級(jí)供給電子而轉(zhuǎn)變成脫氫抗壞血酸，以清除羥自由基（·OH）等自由基[12]。

3 小結(jié)

1）在單因素試驗(yàn)中FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液、H2O2溶液3個(gè)因素對(duì)反應(yīng)體系的影響明顯，而溫度和時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響不明顯。

2）最適體系為：1.8 mmol/L FeSO4溶液2.50 mL，1.8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2.00 mL，0.05%的H2O2溶液0.10 mL，蒸餾水0.50 mL，20 ℃水浴10 min，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度。

3）最適反應(yīng)體系的pH為6.0～6.4；待測(cè)液的乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)反應(yīng)體系有影響，實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)對(duì)待測(cè)液的pH及乙醇體積分?jǐn)?shù)做對(duì)照組修正。

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