周月喬

【摘 要】目的：建立紫外-分光光度法測(cè)定肝水解肽注射液中亞硫酸氫鈉的含量。方法：利用亞硫酸氫根與EDTA2-在酸性條件下，與甲醛和堿性品紅作用，生成紫色復(fù)合物，在555nm處測(cè)定吸光度，以此計(jì)算亞硫酸氫鈉含量。結(jié)果：亞硫酸氫鈉濃度在0.2～8.0（*0.6391）μg·ml-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系，其線性方程為A=0.507C+0.2745， r=0.9992。用廠家樣品進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，回收率在98%以上，RSD小于0.7%（n=6）。結(jié)論：該方法穩(wěn)定，簡(jiǎn)便易行，快速準(zhǔn)確。

【關(guān)鍵詞】分光光度法；亞硫酸氫鈉；肝水解肽注射液

肝水解肽注射液是臨床上廣泛用于促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的藥品，收集到的多家藥品處方中顯示添加了亞硫酸氫鈉。亞硫酸氫鈉是一種藥用輔料[1]，常作為抗氧劑添加于各種藥物制劑中以提高藥品制劑的穩(wěn)定性，然而臨床上多有報(bào)道注射液中亞硫酸氫鈉對(duì)患者肝功能有影響[2-3]，導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶升高，嚴(yán)重的可能引起肝細(xì)胞壞死。因此對(duì)亞硫酸氫鈉在注射劑中加入量進(jìn)行檢測(cè)和控制，是加強(qiáng)藥品質(zhì)量監(jiān)管，提高肝水解肽注射液用藥安全的重要手段。為最大限度地控制肝水解肽注射液中亞硫酸氫鈉的用量，減少不良反應(yīng)，本文參考文獻(xiàn)[4-5]建立了比色法測(cè)定肝水解肽注射液中亞硫酸氫鈉的含量，利用亞硫酸氫根在EDTA2-存在的酸性條件下，與甲醛及堿性品紅作用，生成紫色復(fù)合物，在反應(yīng)完成后于560nm處測(cè)定反應(yīng)液吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)定肝水解肽注射液的亞硫酸氫鈉含量。經(jīng)試驗(yàn)，肝水解肽注射液中其他成分對(duì)亞硫酸氫鈉測(cè)定無(wú)干擾，該方法簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確度、精密度均令人滿意，可作為肝水解肽注射液質(zhì)量控制的重要手段。

1 儀器與試藥

CARY 100型分光光度計(jì)（瓦里安公司）：亞硫酸氫鈉為分析純，其亞硫酸氫鈉含量經(jīng)標(biāo)定為63.91%；鹽酸、甲醛、乙二胺四乙酸二鈉為分析純；堿性品紅為分析純；水為超純水；肝水解肽注射液5個(gè)廠家樣品共11個(gè)批次。

2 試驗(yàn)方法的研究和測(cè)定

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精密稱(chēng)取亞硫酸氫鈉適量，加0.01%EDTA-Na2溶液溶解并稀釋成每1ml中約含亞硫酸氫鈉2.58μg的溶液：精密量取該溶液10ml，0.05%堿性品紅溶液1ml與0.2%甲醛溶液1ml，置25ml比色管內(nèi)，蓋上管塞，搖勻，室溫放置20分鐘，在200nm～800nm范圍進(jìn)行掃描，測(cè)得吸光度值在550～560nm范圍內(nèi)較好且較穩(wěn)定，故選擇555nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 本底干擾考察

按各廠家處方，配制扣除亞硫酸氫鈉的肝水解肽本底溶液，照“測(cè)定波長(zhǎng)選擇”項(xiàng)下方法顯色后于555nm測(cè)得吸光度，與相同顯色方法的空白試液比較吸光度。結(jié)果表明，肝水解肽注射液中各主藥及其它輔料對(duì)本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。

2.3 顯色反應(yīng)所用試劑濃度選擇

2.3.1 亞硫酸氫鈉對(duì)照液的制備

取亞硫酸氫鈉適量，精密稱(chēng)定，加0.01%EDTA-Na2水溶液制成每1ml約含100μg的溶液，精密量取適量，用0.01%EDTA-Na2溶液稀釋成濃度約為0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0（*0.6391）μg·ml-1的系列亞硫酸氫鈉對(duì)照液。

2.3.2 堿性品紅溶液制備

取堿性品紅0.05g置100ml量瓶中，加鹽酸5ml溶解，加水至刻度，搖勻。

1）堿性品紅溶液濃度選擇

在甲醛溶液濃度為0.2%的條件下，分別取0.01%與0.05%堿性品紅水溶液別與系列亞硫酸氫鈉對(duì)照液進(jìn)行顯色反應(yīng)，將測(cè)得吸光度與濃度作線性關(guān)系考察，結(jié)果見(jiàn)表1與表2。結(jié)果表明，在0.05%堿性品紅溶液條件下，亞硫酸氫鈉對(duì)照液的線性關(guān)系優(yōu)于0.01%堿性品紅溶液，故堿性品紅溶液濃度選擇為0.05%。

表1 0.05%的堿性品紅與0.2%的甲醛溶液的線性結(jié)果

表2 0.01%的堿性品紅與0.2%的甲醛溶液的線性結(jié)果

2）鹽酸加入量選擇

取堿性品紅0.05g三份，分別用鹽酸2ml、5ml、8ml溶解，加水至刻度，搖勻。分別與亞硫酸氫鈉濃度對(duì)照液（0.5μg·ml-1）進(jìn)行顯色反應(yīng)，考察鹽酸加入量與顯色反應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，加入5ml或8ml的鹽酸均可保證吸光度落在0.3～0.7的最佳定量范圍內(nèi)，但考慮到試驗(yàn)操作的簡(jiǎn)便性，最終鹽酸加入量選擇為5ml。

表3 不同體積鹽酸加入量測(cè)得的吸光度

2.4 顯色時(shí)間

精密量取0.5μg·ml-1的亞硫酸氫鈉對(duì)照液10ml、0.05%堿性品紅溶液1ml與0.2%甲醛溶液1ml，置于25ml比色管內(nèi)，蓋上管塞，搖勻，分別在室溫下放置10、20、25、30、35、40、50分鐘后測(cè)定顯色液的吸光度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)后30分鐘時(shí)顯色液吸光度最大，與50min時(shí)的吸光度值接近無(wú)較大差別，為提高試驗(yàn)效率，將反應(yīng)時(shí)間選擇為30分鐘。

2.5 線性試驗(yàn)

分別精密量取“2.3.1亞硫酸氫鈉對(duì)照液的制備”項(xiàng)下系列濃度對(duì)照液10ml、0.05%堿性品紅溶液與0.2%甲醛溶液各1ml，置25ml比色管內(nèi)，蓋上管塞，搖勻，室溫下放置30分鐘后于555nm測(cè)定吸光度，同時(shí)以空白試驗(yàn)進(jìn)行校正，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，亞硫酸氫鈉濃度在0.2～8.0（*0.6391）μg·ml-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系，其線性方程為A=0.507×C+0.2745，r=0.999?？紤]到本標(biāo)準(zhǔn)曲線方程所得截距對(duì)結(jié)果影響較大，而且作為抗氧劑亞硫酸氫鈉在其出廠期與貨價(jià)期隨時(shí)間推移含量的波動(dòng)較大，故含量測(cè)定選用了適用濃度范圍較大，結(jié)果較為準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行。

2.6 回收率試驗(yàn)

精密量取廠家D注射液0.5ml，置100ml量瓶中，加0.01%EDTA-Na2溶液稀釋至刻度，搖勻，為供試溶液A。精密稱(chēng)定亞硫酸氫鈉0.4g稀釋至0.4mg/ml（實(shí)際亞硫酸氫鈉含量為0.25564mg/ml），精密量取廠家D注射液0.5ml與上述亞硫酸氫鈉溶液1.0ml置100ml量瓶中，加0.01%EDTA-Na2溶液稀釋至刻度，搖勻，為供試溶液B。照“線性試驗(yàn)”項(xiàng)下方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并分別測(cè)得兩供試溶液的吸光度，平行測(cè)定6份，將結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加樣回收率。測(cè)得的回收率RSD為0.64%。說(shuō)明該方法可靠。結(jié)果見(jiàn)表4：

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 各廠家亞硫酸氫鈉的含量測(cè)定

精密量取待測(cè)廠家肝水解肽注射液1ml，分別置25、50、100ml量瓶中，加0.01%EDTA-Na2溶液稀釋至刻度，搖勻，照“線性試驗(yàn)”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將樣品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算亞硫酸氫鈉含量。各廠家樣品的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5：

表5 不同廠家肝水解肽注射液中亞硫酸氫鈉含量

3 討論

1）本文用比色法測(cè)定肝水解肽注射液中亞硫酸氫鈉的含量，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本方法可行，主藥及其他輔料均無(wú)干擾。

2）試驗(yàn)中分別取0.1%、0.15%、0.2%的甲醛溶液，在堿性品紅溶液濃度為0.05%的條件下，分別與系列亞硫酸氫鈉對(duì)照液進(jìn)行顯色反應(yīng)，結(jié)果表明甲醛溶液濃度變化對(duì)本反應(yīng)影響較小可以忽略，考慮甲醛濃度越大顯色反應(yīng)越充分，故選擇濃度為0.2%的甲醛溶液。

3）試驗(yàn)中還對(duì)顯色時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果表明溫度對(duì)反應(yīng)溶液的最大吸收波長(zhǎng)并沒(méi)有影響，但溫度越高，反應(yīng)速度快，吸光度不穩(wěn)定；溫度低，反應(yīng)時(shí)間與靈敏度相應(yīng)延長(zhǎng)與降低，最后確定本反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度為20～25℃，對(duì)照管與樣品管需在相同條件下顯色，以保證結(jié)果的可靠性。

4）由檢測(cè)結(jié)果可以看出，不同廠家肝水解肽注射液中亞硫酸氫鈉的含量不同，含量差別較大。由于亞硫酸氫鈉含量過(guò)大會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用，含量過(guò)低又不能起抗氧劑的作用，因此希望有關(guān)部門(mén)盡快制訂出肝水解肽注射液中亞硫酸氫鈉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以規(guī)范各廠家的生產(chǎn)過(guò)程中的亞硫酸氫鈉用量，保證廣大患者的用藥安全。

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[責(zé)任編輯：湯靜]