◆劉艷 孟威 周毓麟 王貞佐 王迪

發(fā)酵實踐教學(xué)平臺建設(shè)探索*

◆劉艷 孟威 周毓麟 王貞佐 王迪

發(fā)酵工程作為現(xiàn)代生物技術(shù)四大工程的核心，在實踐教學(xué)中廣泛設(shè)課。但實驗中存在發(fā)酵液易染菌等問題，且無法根據(jù)需要進行pH值、補氣和助劑等相關(guān)補給調(diào)節(jié)。吉林大學(xué)國家級生物實驗教學(xué)示范中心根據(jù)現(xiàn)有校內(nèi)實訓(xùn)基地條件開發(fā)三級發(fā)酵罐接種、補料及水循環(huán)利用自控系統(tǒng)，收到可喜的社會經(jīng)濟效益，得到廣泛應(yīng)用與推廣。

發(fā)酵工程；實踐教學(xué)；接種；補料

10.3969/j.issn.1671-489X.2015.24.164

發(fā)酵工程作為現(xiàn)代生物技術(shù)四大工程的核心，是一門實踐性極強的學(xué)科，涉及知識面廣泛，是醫(yī)藥、輕工食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、能源等研究生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)和必不可少的重要環(huán)節(jié)，是工業(yè)化和轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)，是傳統(tǒng)粗放型經(jīng)濟增長方式轉(zhuǎn)變?yōu)橘Y源節(jié)約型、環(huán)境友好型的必然道路。發(fā)酵工程實踐教學(xué)在專業(yè)課程體系中舉足輕重，起著承上啟下的作用，其平臺建設(shè)水平直接影響著教學(xué)質(zhì)量，影響著學(xué)生的專業(yè)素質(zhì)。在發(fā)酵過程中如何控制與實現(xiàn)由菌種逐級擴培罐到發(fā)酵生產(chǎn)罐的自動接菌、發(fā)酵罐的自動補料、用水的回收循環(huán)利用自動控制，是目前本科生發(fā)酵工程實踐教學(xué)以及科研生產(chǎn)的瓶頸問題。

1 現(xiàn)有發(fā)酵罐存在的問題

發(fā)酵過程優(yōu)化與放大一直是其發(fā)展的關(guān)鍵問題。目前大多數(shù)高校的發(fā)酵實踐平臺以單罐發(fā)酵為主，在進行擴大發(fā)酵時需將發(fā)酵液由小罐取出，放入相應(yīng)大容量的發(fā)酵罐中，在移罐過程中容易造成發(fā)酵液染菌，影響實驗結(jié)果，且單罐發(fā)酵過程中根據(jù)需要調(diào)整相關(guān)變量時，僅能進行pH值、補氣、助劑等單一因素的調(diào)節(jié)，同時進行物料自動接種、自動補料的發(fā)酵罐尚無。

2 設(shè)計思路

發(fā)酵工程的特點 發(fā)酵工程是21世紀工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的核心，通過基礎(chǔ)理論研究、共性關(guān)鍵技術(shù)研究，實現(xiàn)產(chǎn)品的優(yōu)化和放大，開啟了生物經(jīng)濟時代，產(chǎn)品涉及食品、醫(yī)藥、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)、環(huán)境保護、生物能源等諸多方面。發(fā)酵工程分為上游、中游和下游工程。其中，上游工程是優(yōu)化種株、確定最優(yōu)發(fā)酵條件的過程；中游工程是指在最優(yōu)發(fā)酵條件下，大量產(chǎn)生和積累專門的代謝產(chǎn)物的工藝過程，需要有嚴格的無菌生長環(huán)境，多種變量因素在以“速率”級變化的過程中促進高產(chǎn)菌株（或細胞株）的逐級擴培，通過對生化反應(yīng)做定量的和動力學(xué)方面的考察，調(diào)整變量因素，得到最優(yōu)中游產(chǎn)物，進行下游的分離純化。

結(jié)合現(xiàn)有條件改造升級設(shè)計 發(fā)酵過程是一個隨著時間變化的（時變的）、非線性的、多變量輸入和輸出的動態(tài)的生物學(xué)過程，產(chǎn)生大量宏觀生物信息和海量數(shù)據(jù)，是一個時空多尺度結(jié)構(gòu)的復(fù)雜系統(tǒng)。如何在海量數(shù)據(jù)中尋找過程優(yōu)化敏感參數(shù)，是發(fā)酵過程優(yōu)化與放大的關(guān)鍵點［1］。以往多采用實驗室手工測定參數(shù)，進行補給調(diào)整，但易造成染菌等問題，在線測定是發(fā)酵工程必然的發(fā)展趨勢。

利用吉林大學(xué)國家級生物實驗教學(xué)示范中心（以下簡稱實驗中心）校內(nèi)實訓(xùn)平臺現(xiàn)有獨立的5 L、10 L、100 L發(fā)酵罐，設(shè)計開發(fā)逐級放大發(fā)酵過程中自動接種、自動補料、循環(huán)水自動利用等系統(tǒng)。在原有上位機及原有軟件控制系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，與企業(yè)研發(fā)部門合作進行檢測參數(shù)與控制參數(shù)相關(guān)性擬合，更新相應(yīng)軟件功能，實現(xiàn)接種、補料、水循環(huán)利用的自動控制。同時，根據(jù)反饋控制條件，要求選配相應(yīng)附屬設(shè)施，并布局管路、連接件、閥門的選擇與安裝。

圖1 逐級放大接種示意圖

圖2 自動接菌監(jiān)測與控制系統(tǒng)示意圖

圖3 自動補料系統(tǒng)示意圖

3 三級發(fā)酵罐的開發(fā)

自動接種系統(tǒng)的開發(fā) 發(fā)酵過程中菌種污染將導(dǎo)致整個發(fā)酵過程的失敗，影響實踐教學(xué)順利完成，并導(dǎo)致實驗教學(xué)成本加大。為此以5 L、10 L、100 L三個獨立的發(fā)酵罐為基礎(chǔ)，以菌液濃度（光密度OD值）為反饋控制檢測指標，通過密閉管路和電磁閥的路徑連接，實現(xiàn)菌種培養(yǎng)和逐級放大發(fā)酵菌種的自動接種控制［2］（見圖1）。

自動接種系統(tǒng)是在一級種子培養(yǎng)中，通過菌種對數(shù)生長期OD值設(shè)定與檢測反饋信號，自動控制電磁閥的開啟，靠一級種子罐自身壓力將培養(yǎng)好的種子轉(zhuǎn)移到二級種子罐中。同理，自動控制二級、三級種子的培養(yǎng)與接種，從而實現(xiàn)逐級放大發(fā)酵接種過程的自動控制。整個接種過程在一個密閉過程中完成，避免了外加式接種帶來的發(fā)酵染菌危險（見圖2）。

自動補料系統(tǒng)開發(fā) 發(fā)酵過程中需要保證一定的營養(yǎng)物質(zhì)，以使菌體正常生長和代謝產(chǎn)物合成。在分批發(fā)酵中，因一次投料過多，造成發(fā)酵液環(huán)境突變、菌絲大量生長、泡沫難控制、裝罐系數(shù)減少等問題。為解決這些問題，在10 L、100 L發(fā)酵系統(tǒng)中，針對常用的流加式補料方式開發(fā)自動補料系統(tǒng)（見圖3）。

通過選擇與過程直接關(guān)系的可檢測參數(shù)作為控制指標（如可以測量、控制發(fā)酵液pH，采用定量控制葡萄糖流加，穩(wěn)定pH在代謝最旺盛水平），采用計量罐、流量計（電磁流量計、液體質(zhì)量流量計）、蠕動泵、電磁閥和控制器來實現(xiàn)連續(xù)補料控制。補料時，輸入補料率等相關(guān)參數(shù)進行數(shù)據(jù)處理，通過入料閥、計量罐、液位電極、出料閥等進行控制，實現(xiàn)連續(xù)流加補料過程。整個過程是在一個密閉環(huán)境中進行，避免發(fā)酵過程的雜菌污染，提高裝罐系數(shù)，細胞質(zhì)量可控，保持pH穩(wěn)定，解除底物抑制、產(chǎn)物反饋抑制和分解阻遏（見圖4）。

圖5 凈化水循環(huán)利用自動控制系統(tǒng)示意圖

循環(huán)水利用自動控制系統(tǒng)的開發(fā) 發(fā)酵過程中微生物的生化反應(yīng)要產(chǎn)生大量熱量，這些熱量必須及時被帶出罐體，否則培養(yǎng)基溫度升高，就會影響發(fā)酵最佳條件，引起微生物發(fā)酵中斷［3］。另外，培養(yǎng)基經(jīng)實罐滅菌和連續(xù)滅菌后溫度較高，需要足夠的冷卻介質(zhì)將熱量帶出罐體。發(fā)酵罐的冷卻，主要是考慮微生物發(fā)酵過程的發(fā)酵熱和機械攪拌消耗的功率移送給培養(yǎng)基的熱量［4］。此外還要考慮發(fā)酵罐消毒的冷卻或?qū)嵪蟮睦鋮s時間。發(fā)酵罐滅菌冷卻、溫控均需水來完成，不僅造成大量水流失，而且長期用自來水冷卻會產(chǎn)生大量水垢，對發(fā)酵設(shè)備、控制閥及管路均會產(chǎn)生危害。為節(jié)約用水、保護設(shè)備不受損壞，研發(fā)利用凈化水循環(huán)利用自動控制系統(tǒng)（見圖5）。

通過設(shè)計給水系統(tǒng)和回水系統(tǒng)的有效聯(lián)動，實現(xiàn)發(fā)酵過程中滅菌冷卻用水、控溫用水的循環(huán)利用。

1）給水系統(tǒng)：采用設(shè)計密閉水位自動控制的1000 L純凈水的水箱，靠自然壓力或水泵補充壓力（控制水流量和壓力），供給發(fā)酵滅菌后冷卻水和對發(fā)酵過程中控溫用水的供給。

2）回水系統(tǒng)：發(fā)酵罐夾套出水后，匯集到200 L帶水位控制的水箱中；當水位達到一定時，水泵自動開啟打到1000 L水箱中，實現(xiàn)純凈水的重復(fù)循環(huán)利用。

4 三級發(fā)酵罐的經(jīng)濟效益及推廣應(yīng)用

社會經(jīng)濟效益 在校內(nèi)實訓(xùn)基地原有獨立發(fā)酵設(shè)備基礎(chǔ)上，通過軟硬件改造，實現(xiàn)接種過程的自動控制，避免發(fā)酵過程染菌，大大降低發(fā)酵過程因污染造成的風(fēng)險；開發(fā)流加自動補料系統(tǒng)，縮短發(fā)酵過程周期，提高單位發(fā)酵目的產(chǎn)物收率，節(jié)約發(fā)酵成本，縮短教學(xué)周期，增加受益學(xué)生人數(shù)；開發(fā)的水循環(huán)綜合利用系統(tǒng)，使每學(xué)年發(fā)酵工程實踐教學(xué)節(jié)約水量200噸左右，既避免了水源流失，又保護了設(shè)備不被腐蝕。

推廣應(yīng)用 實驗中心三級發(fā)酵系統(tǒng)自開發(fā)應(yīng)用以來，共開出綜合性、創(chuàng)新性實驗項目九項。其中，生物技術(shù)專業(yè)綜合實驗、生物科學(xué)專業(yè)實驗兩項，生物工程校內(nèi)實訓(xùn)實驗兩項，研究創(chuàng)新實驗四項，開放創(chuàng)新實驗一項。共接納1420多名本科生，年授課平均6500人學(xué)時左右。為高校教師培訓(xùn)和行業(yè)培訓(xùn)300多人；對外開放項目合作六項。目前，已與國內(nèi)外800多所高校實驗室學(xué)習(xí)交流，均對此系統(tǒng)在教學(xué)科研方面的不斷改進與創(chuàng)新給予高度評價［5］。

5 展望

提高培養(yǎng)質(zhì)量，強化實踐育人，重視實踐教學(xué)環(huán)節(jié)，是創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才培養(yǎng)模式改革的核心內(nèi)容［6］。發(fā)酵工程在國民經(jīng)濟發(fā)展中具有重要地位，發(fā)酵實踐教學(xué)平臺將為其進入工業(yè)生產(chǎn)與商業(yè)開發(fā)階段培養(yǎng)大量具有實踐能力的創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才。發(fā)酵工程涉及生物學(xué)與多學(xué)科交叉研究，結(jié)果涉及多尺度參數(shù)，發(fā)酵過程中某一尺度上發(fā)生微擾，最終都會在宏觀過程中有所反映。多尺度發(fā)酵過程優(yōu)化放大方法，勢必成為先進的“通用技術(shù)”。推進我國輕工與生物醫(yī)藥發(fā)酵工程產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，應(yīng)在多尺度參數(shù)相關(guān)分析的基礎(chǔ)上，開展系統(tǒng)生物學(xué)與代謝網(wǎng)路構(gòu)建，合成生物學(xué)在發(fā)酵工程中的應(yīng)用。完善發(fā)酵實踐教學(xué)平臺，進一步提高實踐教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)應(yīng)用復(fù)合型人才，使人才培養(yǎng)與社會經(jīng)濟發(fā)展形成良性互動，是高校相關(guān)專業(yè)教師的責(zé)任與義務(wù)。■

［1］宮衡，陳長華，葉勤.發(fā)酵工程教學(xué)的改革與實踐［J］.化工高等教育，2005，84（2）:36-38.

［2］劉艷，孟威，周毓麟.一種生物纖維素發(fā)酵系統(tǒng)：中國，201520108873.4［P］.2015.

［3］李友元，陳長華，宮衡.發(fā)酵工程實驗教學(xué)改革探索與實踐［J］.化工高等教育，2013，134（6）:27-30.

［4］張嗣良.發(fā)酵工程原理［M］.北京:高教出版社，2013.

［5］劉艷，閆國棟，孟威，等.創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育與專業(yè)教育的深度融合［J］.中國大學(xué)教學(xué)，2014（11）:35-37.

［6］國務(wù)院.國務(wù)院辦公廳關(guān)于深化高等學(xué)校創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育改革的實施意見.國辦發(fā)〔2015〕36號.

Fermentation Practice Teaching Platform Construction

LIU Yan， MENG Wei， ZHOU Yulin， WANG Zhenzuo， WANG Di

Fermentation engineering is the core of the four modern biotechnology engineering， widely sets course in the teaching practice. However， there are still some problems in the experiment such as the fermented liquid tingible bacteria， which can not adjust to pH， tonifying qi and fertilizer supplies. Center Lab of General Biology of Jilin University according to the existing campus training base conditions has developed tertiary fermenter inoculation， and the water cycle use of automatic control system， receiving great social and economic benefits， along with wide application and promotion.

fermentation engineering； the practice teaching； vaccination； the loading

642.44

B

1671-489X（2015）24-0164-04

*項目來源：吉林省教育教學(xué)改革重點項目“發(fā)酵罐菌種和補料自動轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的開發(fā)”（基金編號：409020720008）。

作者：劉艷，吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高級工程師，研究方向為實踐教學(xué)與管理研究；王迪，通訊作者，吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院講師，研究方向為發(fā)酵工程及藥理學(xué)的教學(xué)與研究；孟威、周毓麟、王貞佐，吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（130012）。