楊麗娜，喬 楠，胡敏予，陳繼華，林 茜，周光宇，魏 薇，朱柳鳳

（中南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，湖南 長沙 410078）

近年來，酒精性肝損傷患病人數(shù)逐年增加，已成為一種世界性疾病，給家庭和社會帶來極大負(fù)擔(dān)。酒精性肝損傷是由于長期、大量飲酒或其他含乙醇的飲料所導(dǎo)致的以肝臟損害為主的病理改變，初期通常表現(xiàn)為酒精性脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化。對酒精性肝損傷進(jìn)行預(yù)防干預(yù)可減少其發(fā)病率，對于減輕其危害有重要意義。鞣花酸是一組天然多酚類化合物，廣泛存在于各種植物組織中。鞣花酸是沒食子酸的二聚衍生物，具有酚類化合物的結(jié)構(gòu)，其藥理作用多樣，生物活性較強(qiáng)［1－2］，多項(xiàng)研究［3－7］表明：鞣花酸有明顯的清除自由基、抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化、促凝血、抗肝損傷和抗腫瘤等作用。但國內(nèi)至今尚未見鞣花酸對酒精性肝損傷預(yù)防作用的研究報道。本研究通過建立酒精性肝病小鼠模型，探討鞣花酸對酒精性肝損傷的保護(hù)作用，闡明其可能的作用機(jī)制，為鞣花酸應(yīng)用于酒精性肝病的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑和儀器 昆明小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量為18～22g，SPF級，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK （湘）2009－0012。鞣花酸粉劑 （90%）購自陜西錦泰生物工程公司，無水乙醇購自天津市大茂化學(xué)試劑廠，超氧化物歧化酶 （SOD）、丙二醛 （MDA）和谷光甘肽 （GSH）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。全自動生化分析儀（AU2700，日本奧林巴斯公司），酶標(biāo)儀 （Power Waves XSC2，美國MD公司）。

1.2 動物分組和模型制備 50只昆明小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為空白對照組，肝損傷模型組和低、中、高劑量鞣花酸組，每組10只?？瞻讓φ战M和肝損傷模型組小鼠給予1%羧甲基纖維素鈉溶劑灌胃，不同劑量鞣花酸組小鼠分別以160、320和480mg·kg－1鞣花酸灌胃，連續(xù)15d。末次灌胃后，空白對照組小鼠灌胃等量蒸餾水，其他組小鼠灌胃50%乙醇12mL·kg－1，禁食不禁水，16h后小鼠眼球取血，頸椎脫臼法處死動物，解剖，取出肝臟，稱質(zhì)量，計(jì)算肝臟系數(shù)。肝臟系數(shù)＝臟器濕質(zhì)量／體質(zhì)量。

1.3 檢測指標(biāo)和方法 各組小鼠眼球取血，4000r·min－1離心10min，分離血清，全自動生化分析儀測定血清、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （AST）活性和甘油三酯（TG）水平。取肝右葉組織塊，稱質(zhì)量，以1∶9的比例量取冰冷生理鹽水，肝臟組織與生理鹽水一同倒入勻漿器的玻璃容器中，勻漿，制成10%組織勻漿，3000～4000r·min－1離心10～15min，取上清液，4℃保存，分光光度計(jì)法測定各組小鼠肝組織中SOD和GSH活性以及MDA水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠血清ALT、AST、SOD、GSH活性及TG、MDA水平以表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肝臟系數(shù) 與空白對照組比較，肝損傷模型組和低劑量鞣花酸組小鼠肝臟系數(shù)升高（P＜0.05或P＜0.01）；與肝損傷模型組比較，低、中、高劑量鞣花酸組小鼠肝臟系數(shù)降低（P＜0.01），各劑量鞣花酸組小鼠肝臟系數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），且鞣花酸劑量越高小鼠的肝臟系數(shù)降低越明顯。見表1。

2.2 各組小鼠血清ALT和AST活性及TG水平與空白對照組比較，肝損傷模型組小鼠血清ALT和AST活性及TG水平明顯升高 （P＜0.05），表明造模成功。低、中和高劑量鞣花酸組小鼠血清ALT和AST活性均明顯低于肝損傷模型組 （P＜0.01），高劑量鞣花酸組小鼠血清TG水平明顯低于肝損傷模型組 （P＜0.05）。見表2。

，g·100g－1）

，g·100g－1）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with control group；△P＜0.05，△△ P＜0.01compared with model group；#P ＜0.05 compared with low dose of ellagic acid group；○ P ＜0.05 compared with medium dose of ellagic acid group.

GroupLiver index Control 5.86±0.41 Model 8.21±0.18＊＊Ellagic acid Low dose 7.09±0.79＊△Medium dose 6.49±0.37△△#High dose 5.55±0.41△△#○

2.3 各組小鼠肝組織中SOD和GSH活性及MDA水平 與空白對照組比較，肝損傷模型組小鼠肝組織勻漿中SOD和GSH活性明顯降低 （P＜0.05或P＜0.01），MDA 水平明顯升高 （P＜0.01）；低、中和高劑量鞣花酸組小鼠肝組織中SOD活性明顯高于肝損傷模型組 （P＜0.05或P＜0.01），MDA水平明顯低于肝損傷模型組（P＜0.05或P＜0.01）；中和高劑量鞣花酸組小鼠肝組織中GSH活性明顯高于肝損傷模型組 （P＜0.05）。見表3。

表2 各組小鼠血清ALT和AST活性及TG水平Tab.2 Activities of serum AST，ALT and levels of TG of mice in various groups （n＝10，）

表2 各組小鼠血清ALT和AST活性及TG水平Tab.2 Activities of serum AST，ALT and levels of TG of mice in various groups （n＝10，）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01compared with model group.

Group ALT［λB／（U·L－1］AST［λB／（U·L－1］TG［cB／（mmol·L－1）］Control 32.03±8.24 77.54±11.21 1.00±0.38 Model 96.45±8.52＊＊ 146.68±35.37＊＊ 1.77±0.39＊Ellagic acid Low dose 78.74±7.20△△ 103.83±14.69△△1.62±0.23＊Medium dose 54.57±7.23△△ 92.44±8.03△△ 1.56±0.24＊High dose 36.53±9.19△△ 79.19±7.45△△ 1.12±0.43△

表3 各組小鼠肝組織中SOD和GSH活性及MDA水平Tab.3 Activities of SOD，GSH and levels of MDA in liver tissue of mice in various groups （n＝10，）

表3 各組小鼠肝組織中SOD和GSH活性及MDA水平Tab.3 Activities of SOD，GSH and levels of MDA in liver tissue of mice in various groups （n＝10，）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01compared with model group.

Group SOD［λB／（U·mg－1）］GSH［λB／（U·mg－1）］MDA ［mB／（mmol·g－1）］Control 209.47±29.25 4.35±0.29 4.19±1.02 Model 74.59±15.14＊＊ 1.06±0.41＊ 11.57±0.92＊＊Ellagic acid Low dose 107.61±12.01△1.76±0.61＊ 7.04±1.73△△Medium dose 145.34±22.06△△ 2.54±0.51△ 5.97±2.41△△High dose 200.79±23.73△△ 3.66±0.57△ 4.82±1.81△△

3 討 論

肝臟在身體中扮演著一個巨大的 “化工廠”的角色，其通過各種生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)揮代謝解毒、免疫防御和消化吸收等功能。從各種途徑進(jìn)入人體的外源化學(xué)物以及體內(nèi)代謝產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)，最終都要在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化或儲留，這些有毒有害物質(zhì)均可能導(dǎo)致急、慢性肝損傷，引起肝細(xì)胞壞死、凋亡、炎癥發(fā)生和纖維化等病理改變。酒精性肝損傷是長期大量飲酒或各類含酒精的飲料所致，通常以酒精性脂肪肝為最初表現(xiàn)，若病變繼續(xù)，可發(fā)展成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化，最終發(fā)展成肝硬化。嚴(yán)重酗酒時可誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死甚至肝功能衰竭。乙醇對肝損害的機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全闡明，可能乙醇代謝過程中產(chǎn)生乙醛，乙醛可與蛋白質(zhì)形成加和物，該加和物有直接損傷肝細(xì)胞的作用，并且可作為新產(chǎn)生的抗原誘導(dǎo)機(jī)體自身免疫反應(yīng)，加重肝細(xì)胞的損傷；肝微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)被激活后，產(chǎn)生的活性氧對肝組織有損傷作用［8］。酒精性肝損傷時血清AST、ALT和TG等指標(biāo)也可有不同程度的改變。

另外，在肝病的發(fā)生過程中，氧化應(yīng)激起著非常重要的作用，各類肝損傷和肝病大多伴隨著氧化還原過程的失平衡。為了抵抗各種原因引起的氧化應(yīng)激，機(jī)體自身具有嚴(yán)密的抗氧化機(jī)制，包括非蛋白硫基如GSH，各種抗氧化酶如SOD等。然而機(jī)體的氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)在機(jī)體遭受到某些有害刺激時可能導(dǎo)致失衡，使大量氧自由基在肝細(xì)胞內(nèi)堆積，使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，因而導(dǎo)致過氧化產(chǎn)物MDA水平升高；另外還有細(xì)胞器功能異常以及炎癥反應(yīng)，最終危害肝臟。故肝組織中的GSH、SOD活性和MDA水平可以作為反映肝損傷程度的敏感指標(biāo)［9－11］。鞣花酸又名胡頹子酸，是沒食子酸的二聚衍生物。鞣花酸以游離形式或結(jié)合形式廣泛存在于多種水果、堅(jiān)果和蔬菜中，尤以結(jié)合形式為主，例如鞣花單寧及葡萄糖甙等［12－13］。鞣花酸在結(jié)構(gòu)上是一種多酚二內(nèi)酯，具有酚類抗氧化劑的特性，鞣花酸具有顯著的抗氧化能力，抗氧化活性是維生素E的50倍，在一些國家已被允許作為食品抗氧化劑使用。

酒精性肝損傷在臨床上是脂肪性肝病的一類病理綜合征，由脂類物質(zhì)在肝臟過度沉積所致，脂類物質(zhì)以TG為主。脂肪在肝臟中的氧化需經(jīng)歷多個階段，每個階段均與自由基有密切關(guān)系［14－15］，脂質(zhì)氧化反應(yīng)的發(fā)生以自由基的生成為必要條件，因而清除自由基即可阻斷脂質(zhì)的氧化反應(yīng)。鞣花酸具有酚類抗氧化劑的特性，而酚類抗氧化劑的抗氧化機(jī)制主要是通過發(fā)生抽氫反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。在此過程中產(chǎn)生的苯氧自由基可阻斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生的苯氧自由基越穩(wěn)定，該抗氧化劑清除自由基的活性就越強(qiáng)［16－18］。鞣花酸具有鄰苯二酚型酚羥基，因此可通過抽氫反應(yīng)與另一個酚羥基相互作用，形成分子內(nèi)氫鍵，從而構(gòu)成一種共振結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)可使苯氧自由基更為穩(wěn)定。另外，鞣花酸分子中相對位置具有的氧原子在P軌道上存在孤對電子，也構(gòu)成了一種共振結(jié)構(gòu)。該2種共振結(jié)構(gòu)可以使鄰位和對位的苯氧自由基具有更好的穩(wěn)定性，因而使鞣花酸具有較高的清除自由基的活性。另有研究［1－3］表明：由于鞣花酸可與二價陽離子結(jié)合，當(dāng)二價金屬離子如鎂離子、鈣離子等存在時，金屬離子對反應(yīng)起到催化作用，鞣花酸可通過與金屬離子的絡(luò)合反應(yīng)抑制自由基的生成。鞣花酸的這些獨(dú)特化學(xué)性質(zhì)使其具有較好清除自由基的能力，從而可中斷氧化反應(yīng)的鏈?zhǔn)竭M(jìn)程，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。

本研究結(jié)果顯示：小鼠灌胃給予50%乙醇16h后，與空白對照組比較，肝損傷模型組小鼠血清ALT和AST活性均升高，SOD活性降低，MDA水平升高，說明酒精性肝病模型的建立成功，而各劑量鞣花酸組小鼠血清ALT、AST活性和TG水平明顯降低，SOD和GSH活性升高而MDA水平降低，以高劑量鞣花酸組小鼠灌胃效果最明顯，提示鞣花酸可能通過其抗氧化作用來實(shí)現(xiàn)對肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

［1］陸晶晶，丁 軻，楊大進(jìn).保健品功能因子鞣花酸研究進(jìn)展 ［J］.食品科學(xué)，2010，31 （21）：451－454.

［2］郭增軍，譚 林，徐 穎，等.鞣花酸類化合物在植物界的分布及其生物活性 ［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22 （3）：519－524.

［3］Vanella L，Barbagallo I，Acquaviva R，et al.Ellagic acid：cytodifferentiating and antiproliferative effects in human prostatic cancer cell lines ［J］.Curr Pharm Des，2013，19 （15）：2728－2736.

［4］Wang N，Wang ZY，Mo SL，et al.Ellagic acid，aphenolic compound，exerts anti－angiogenesis effects via VEGFR－2 signaling pathway in breast cancer ［J］.Breast Cancer Res Treat，2012，134（3）：943－955.

［5］Yuce A，Atessahin A，Ceribasi AO，et al.Ellagic acid prevents cisplatin induced oxidative stress in liver and heart tissue of rats ［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2007，101（2）：345－349.

［6］Girish C，Pradhan SC.Hepatoprotective activities of picroliv，curcumin，and ellagic acid compared to silymarin on carbontetrachloride－induced liver toxicity in mice ［J］.J Pharmacol Pharmacother，2012，3（2）：149－155.

［7］Gu L，Deng WS，Liu Y，et al.Ellagic acid protects lipopolysaccharide／D－galactosamine－induced acute hepatic injury in mice［J］.Int Immunopharmacol，2014，22 （2）：341－345.

［8］Arteel GE.Oxidants and antioxidants in alcohol－induced liver disease ［J］.Gastroenterology，2003，124 （3）：778－790.

［9］Zhou R，Lin J， Wu D.Sulforaphane induces Nrf2and protects against CYP2E1－dependent binge alcohol－induced liver steatosis ［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1840 （1）：209－218.

［10］Osawa T，Ide A，Su JD，et al.Inhibition of lipid peroxidation，by ellagic acid ［J］.J Agr Food Chem，1987，35 （3）：808－812.

［11］劉超群，陳 靜，黃雪松，等.大蒜多糖對慢性酒精中毒小鼠肝損傷的保護(hù)作用 ［J］.吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2012，38 （1）：23－28.

［12］Su JD，Osawa T，Kawakishi S，et al.Tannin antioxidants from Osbeckia chinemsis ［J］.Phytochemistry，1988，27 （3）：1315－1320.

［13］Katsunari I， Atsuko T， Keiko A. Prevention of peroxynitrite－induced oxidation and nitration reactions by ellagic acid ［J］.Food Chem，2009，112 （1）：185－188.

［14］Mohammed F.Alcoholic hepatitis ［J］.N Engl J Med，2009，361 （15）：1512－1513.

［15］Purohit V，Gao B，Song BJ. Molecular mechanisms of alcoholic fatty liver ［J］.Alcohol Clin Exp Res，2009，33 （2）：191－205.

［16］李 慶，姚 開，譚 敏.新型天然抗氧化劑鞣花酸 ［J］.四川食品與發(fā)酵，2001，37 （4）：10－14.

［17］李 妍，劉玉蓮，紀(jì)朋艷，等.五味子水提物對微波輻射引起大鼠肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的預(yù)防作用 ［J］.吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2013，39 （6）：1173－1176.

［18］方艷秋，齊亞靈，蘆小單，等.環(huán)氧合酶2抑制劑NS－398對人肝癌細(xì)胞SMMC－7721增殖與凋亡的影響 ［J］.吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2013，39 （6）：1190－1194.