趙璐，戴振華，張賀秋，馮曉燕

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）核心蛋白是一種多功能結(jié)構(gòu)蛋白，除具有組裝病毒顆粒的功能外，還可與宿主細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)相互作用，參與多種轉(zhuǎn)錄因子的反式激活，或通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化失衡，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌（HCC）的發(fā)生[1-3］。因此，HCV核心蛋白在HCV致肝癌過程中具有重要作用?，F(xiàn)有研究表明，在HCV致癌過程中，核心蛋白可以通過多種方式激活MAPK/ERK 信號(hào)通路，從而激活轉(zhuǎn)錄因子CREB/ATF、C/EBPα的表達(dá)，最終作用于c-Fos 使細(xì)胞發(fā)生癌變。我們將就此方面的研究進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述。

1 HCV核心蛋白與MAPK信號(hào)通路

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及細(xì)胞核，參與細(xì)胞增殖、腫瘤形成、炎癥性疾病、應(yīng)激等生理過程。從酵母到哺乳類細(xì)胞中，MAPK 通路都通過保守的三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)MAPKKK-MAPKK-MAPK 進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖1）。MAPKKK（MAPKK 激酶）和MAPKK（MAPK 激酶）均為絲氨酸（Ser）/蘇氨酸（Thr）蛋白激酶，MAPKK 由MAPKKK 活化后通過雙磷酸化MAPK 活化環(huán)中Thr-Xaa-Tyr 基序的Thr 和Tyr 殘基，激活MAPK。MAPK 家族成 員主要包括ERK1/2、JNK、p38 和ERK5/BMK1，相應(yīng)的 通路為MAPK/ERK、SAPK/JNK、p38 MAPK 和ERK5/BMK1，同時(shí)這4 條通路之間存在著“對(duì)話（cross-talk）”。大量研究表明，在HCV 核心蛋白致癌過程中都會(huì)激活MAPK 信號(hào)通路。如Erhard 等利用表達(dá)HCV 核心蛋白的HepG2細(xì)胞系研究，發(fā)現(xiàn)HCV 核心蛋白的表達(dá)能激活MAPK 信號(hào)通路[4]；Tsuchihara 等在穩(wěn)定表達(dá)HCV 核心蛋白的BALB/3T3 A31-1-1 細(xì)胞系中，也同樣發(fā)現(xiàn)核心蛋白可激活MAPK通路。

圖1 MAPK三級(jí)級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)通路示意圖

2 HCV 核心蛋白通過MAPK/ERK 信號(hào)通路對(duì)轉(zhuǎn)錄因子c-Fos的調(diào)控作用

2.1 核心蛋白與轉(zhuǎn)錄因子c-Fos

轉(zhuǎn)錄因子AP-1 家族包括c-Fos 和c-Jun 亞族。c-Fos是一類與細(xì)胞增殖相關(guān)的原癌基因，在大多數(shù)正常細(xì)胞內(nèi)均低水平表達(dá)，而在許多惡性腫瘤及其癌前病變中出現(xiàn)高水平表達(dá)。c-Fos 能夠通過調(diào)控MMP 活性調(diào)節(jié)血管生成因子的表達(dá)而破壞腫瘤細(xì)胞周圍組織，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)血管生成及細(xì)胞遷移，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性[5]。因此，c-Fos的激活是判定細(xì)胞由正常狀態(tài)向疾病狀態(tài)轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要的生物學(xué)指標(biāo)[6]。

來自不同團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果顯示HCV 核心蛋白與轉(zhuǎn)錄因子c-Fos 存在密切關(guān)系。Kato 等比較了7種HCV 蛋白對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活作用，發(fā)現(xiàn)HCV 核心蛋白可顯著激活A(yù)P-1（c-Fos 和c-Jun）、SRE和NF-κB[7]；Tsutsumi等在HCV 核心蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠中檢測(cè)到AP-1活性顯著增強(qiáng)。另一方面，也有少數(shù)研究顯示核心蛋白不能作用于c-Fos，甚至?xí)档蚦-Fos 的表達(dá)。例如Erhard 等在表達(dá)HCV 核心蛋白的HepG2 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HCV 核心蛋白能激活c-Jun，但卻沒有激活c-Fos[8]；馮德云等發(fā)現(xiàn)在表達(dá)HCV 核心蛋白的QSG7701 肝細(xì)胞系中c-Fos 和c-Jun 的表達(dá)水平明顯下降，并且采用EMSA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)c-Fos和c-Jun的DNA 結(jié)合活性也顯著減弱[9]。雖然仍存在一些爭(zhēng)議，但絕大多數(shù)研究結(jié)果支持HCV 核心蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄因子c-Fos的激活作用。

2.2 MAPK/ERK 信號(hào)通路與核心蛋白激活轉(zhuǎn)錄因子c-Fos

MAPK/ERK（Ras/Raf/MEK/ERK）信號(hào)通路存在于所有的真核細(xì)胞中，是主要的MAPK 信號(hào)通路之一，參與細(xì)胞生長、增殖、凋亡等生理過程。有報(bào)道顯示c-Fos 的激活是通過Ras/Raf/MEK/ERK 信號(hào)通路磷酸化轉(zhuǎn)錄因子ATF/CREB 和Elk-1，隨后激活即早基因c-Fos 的表達(dá)（圖2）。綜合文獻(xiàn)報(bào)道，核心蛋白可以通過多種方式參與到Ras/Raf/MEK/ERK 信號(hào)通路中，最終激活轉(zhuǎn)錄因子c-Fos。以下為詳述。

Ras/Raf/MEK/ERK 信號(hào)通路最上游的刺激物是被鑒定為人類原癌基因的Ras。Ray 等發(fā)現(xiàn)HCV 核心蛋白和H-Ras共轉(zhuǎn)染原代大鼠胚胎成纖維母細(xì)胞REF后，出現(xiàn)細(xì)胞增殖和癌變的性狀，這表明核心蛋白能夠與H-Ras 協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化[1]（圖2-①）。

MAPKKK 成員Raf 也是一種原癌基因，它與細(xì)胞增殖、分化、生存、附著及血管生成的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。在HepG2細(xì)胞中，HCV核心蛋白與14-3-3蛋白的相互作用使Raf 活性增強(qiáng)。Aoki 等在穩(wěn)定表達(dá)HCV 核心蛋白的CCL13 細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)HCV 核心蛋白能與14-3-3 蛋白作用，激活MAPK 的上游激酶Raf、MEK1 和ERK1/2[10]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明核心蛋白可以通過與14-3-3 蛋白相互作用的方式激活Raf，從而激活MEK-ERK 途徑（圖2-②）。此外，Giambartolomei等發(fā)現(xiàn)HCV核心蛋白的持續(xù)表達(dá)可使Raf 高水平表達(dá)，從而激活MAPK 信號(hào)通路[11]（圖2-③）。

Hayashi 等研究了HCV 核心蛋白對(duì)MAPK/ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定表達(dá)核心蛋白的HepG2 細(xì)胞中，核心蛋白可顯著激活MAPK/ERK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，ERK磷酸化活性比對(duì)照提高了2.5倍。在該細(xì)胞中加入MEK1 抑制劑PD98059 后，原先核心蛋白激活的ERK活性被抑制，推測(cè)核心蛋白對(duì)MEK和ERK 具有激活作用[12]（圖2-④、⑤）。相反，F(xiàn)ukuda等發(fā)現(xiàn)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCV 核心蛋白的細(xì)胞中，核心蛋白可增強(qiáng)MEK 下游Elk1 的激活，而對(duì)ERK 活性及Elk1 磷酸化沒有影響[13]。同樣，Tsuchihara 等觀察到HCV核心蛋白能激活MAPK及其下游的靶分子血清反應(yīng)元件（SRE），促進(jìn)MEK 下游分子Elk1 的激活和磷酸化但不影響ERK。而Yao 等在研究HCV 核心蛋白對(duì)于T 細(xì)胞激活早期事件的影響中發(fā)現(xiàn)，HCV核心蛋白抑制ERK 和絲裂原激活ERK 激酶（MEK）蛋白的磷酸化[14]?？梢姡P(guān)于HCV 核心蛋白對(duì)MEK下游分子的影響，不同的研究呈現(xiàn)不一致的結(jié)果，這可能與實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)與實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)。

CREB/ATF 是MAPK/ERK 信號(hào)通路的下游反應(yīng)底物之一，同時(shí)又有研究證實(shí)CREB 是c-Fos 啟動(dòng)子鈣離子反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，c-Fos啟動(dòng)子序列中包含3 個(gè)CREB 反應(yīng)元件[15]。所以，HCV 核心蛋白也可能通過Ras/Raf/MEK/ERK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)CREB 作用于c-Fos，導(dǎo)致細(xì)胞癌變（圖2-⑥）。

CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族（C/EBP）也是MAPK/ERK 信號(hào)通路的下游反應(yīng)底物之一，家族成員包括C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε、C/EBPζ。C/EBP 在機(jī)體生長發(fā)育過程中，主要通過對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)參與各組織器官的細(xì)胞增殖與分化。MAPK 信號(hào)通路ERK1/2 可激活C/EBP 家族[16]，而c-Fos基因的啟動(dòng)子中含有功能性的C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)C/EBP 能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB、AP-1、Sp1、ATF/CREB）相互作用，那么核心蛋白能否通過Ras/Raf/MEK/ERK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)C/EBP和c-Fos 的表達(dá)而引起HCC 的發(fā)生，還須進(jìn)一步的研究（圖2-⑦）。

圖2 HCV核心蛋白通過MAPK通路對(duì)c-Fos基因的調(diào)節(jié)示意圖

HCV 感染大部分會(huì)轉(zhuǎn)變成持續(xù)性感染，最終可能導(dǎo)致HCC。在對(duì)HCV 致癌機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)HCV核心蛋白在不同生理?xiàng)l件下會(huì)通過MAPK 通路參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而促進(jìn)感染細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化，在HCV 致HCC 的過程中起到了關(guān)鍵作用。核心蛋白通過MAPK/ERK信號(hào)通路對(duì)轉(zhuǎn)錄因子c-Fos 的調(diào)控作用也成為研究者關(guān)注的重點(diǎn)，此條通路中的蛋白也可能成為HCV相關(guān)HCC 治療的靶點(diǎn)。本文綜述了核心蛋白參與上述途徑的各個(gè)位點(diǎn)，有些已有實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持，有些尚待進(jìn)一步證明，以期能夠?yàn)檠芯空咛峁┮恍┧悸?，更全面地闡釋HCV 核心蛋白-MAPK/ERK-c-Fos 致肝細(xì)胞癌的作用機(jī)制。

[1]Levrero M.Viral hepatitis and liver cancer:the case of hepatitis C[J].Oncogene,2006,25(27):3834-3847.

[2]Aravalli R N,Cressman E N,Steer C J.Cellular and molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma:an update[J].Arch Toxicol,2013,87(2):227-247.

[3]劉嬌.丙型肝炎病毒核心蛋白誘導(dǎo)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路活化及其分子致病機(jī)制的研究[D].重慶:重慶醫(yī)科大學(xué),2011.

[4]Erhardt A,Hassan M,Heintges T,et al.Hepatitis C virus core protein induces cell proliferation and activates ERK,JNK,and p38 MAP kinases together with the MAP kinase phosphatase MKP-1 in a HepG2 Tet-Off cell line[J].Virology,2002,292(2):272-284.

[5]Kim M,Murakami A,Kawabata K,et al.(-)-Epigallocatechin-3-gallate promotes pro-matrix metalloproteinase-7 production via activation of the JNK1/2 pathway in HT-29 human colorectal cancer cell[J].Carcinogenesis,2005,26(9):1553-1562.

[6]陳建勇,王聰,王娟,等.MAPK 信號(hào)通路研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥科學(xué),2011,1(8):32-34.

[7]Kato N,Yoshida H,Ono-Nita S K,et al.Activation of intracellular signaling by hepatitis B and C viruses:C viral core is the most potent signal inducer[J].Hepatology,2000,32(2):405-412.

[8]Tsutsumi T,Suzuki T,Moriya K,et al.Alteration of intrahepatic cytokine expression and AP-1 activation in transgenic mice expressing hepatitis C virus core protein[J].Virology,2002,304(2):415-424.

[9]馮德云.肝細(xì)胞癌中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常及HCV 核心蛋白對(duì)人肝細(xì)胞生物學(xué)特性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[D].長沙:中南大學(xué)腫瘤研究所,2004.

[10]Hayashi J,Aoki H,Kajino K,et al.Hepatitis C virus core protein activates the MAPK/ERK cascade synergistically with tumor promoter TPA,but not with epidermal growth factor or transforming growth factor α[J].Hepatology,2000,32(5):958-961.

[11]Giambartolomei S,Covone F,Levrero M,et al.Sustained activation of the Raf/MEK/Erk pathway in response to EGF in stable cell lines expressing the Hepatitis C Virus(HCV) core protein[J].Oncogene,2001,20(20):2606-2610.

[12]Hayashi J,Aoki H,Kajino K,et al.Hepatitis C virus core protein activates the MAPK/ERK cascade synergistically with tumor promoter TPA,but not with epidermal growth factor or transforming growth factor alpha[J].Hepatology,2000,32(5):958-961.

[13]Fukuda K,Tsuchihara K,Hijikata M,et al.Hepatitis C virus core protein enhances the activation of the transcription factor,Elk1,in response to mitogenic stimuli[J].Hepatology,2001,33(1):159-165.

[14]Yao Z Q,Nguyen D T,Hiotellis A I,et al.Hepatitis C virus core protein inhibits human T lymphocyte responses by a complement-dependent regulatory pathway[J].J Immunol,2001,167(9):5264-5272.

[15]姚繁榮,曹東元,趙晏.cAMP 應(yīng)答元件結(jié)合蛋白與痛覺調(diào)制[J].生理科學(xué)進(jìn)展,,2006,37(2):125-128.

[16]Hong S,Skaist A M,Wheelan S J,et al.AP-1 protein induction during monopoiesis favors C/EBP:AP-1 heterodimers over C/EBP homodimerization and stimulates FosB transcription[J].J Leukoc Biol,2011,90(4):643-651.