馮世鵬

海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，海南 ?？?570228

依據(jù)植物對(duì)病原物的抗病機(jī)制不同，將植物抗病性分為被動(dòng)抗性（passive resistance）和主動(dòng)抗性（active resistance）。被動(dòng)抗性（也稱物理化學(xué)抗性）是植物自身性狀所決定的抗病性，如植物通過結(jié)構(gòu)屏障（如角質(zhì)層、蠟質(zhì)等）和體內(nèi)的化學(xué)成分（如次生代謝產(chǎn)物等）阻止病原物浸入[1]。主動(dòng)抗性指植物在受到病原物侵染或誘導(dǎo)劑處理時(shí)誘導(dǎo)激活一系列防衛(wèi)反應(yīng)，抑制病原物浸染，包括一系列生理生化的變化和抗病相關(guān)基因的激活表達(dá)，如侵染部位的木質(zhì)化、富含羥脯氨酸的糖蛋白增加、植保素（phytoalexins）積累等[2]。

植物的主動(dòng)抗病性主要借助于植物的先天免疫反應(yīng)，可分為2 種。第一種是基于細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（pattern-recognization receptors，PRR）對(duì)病原物相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）的識(shí)別，該免疫過程被稱為PAMP觸發(fā)的免疫（PAMP triggered immunity，PTI），該免疫過程可幫助植物抵抗大部分病原微生物的入侵；第二種免疫發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)部，主要依靠抗病基因（resistance gene，R gene）編碼的蛋白產(chǎn)物直接或間接地識(shí)別病原微生物產(chǎn)生的效應(yīng)因子（effector）并激發(fā)免疫反應(yīng)，也稱為效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫（effector triggered immunity，ETI）。

廣義的效應(yīng)因子是指病原物可引起宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變的蛋白或小分子物質(zhì)，它們促進(jìn)侵染進(jìn)程，或激發(fā)免疫反應(yīng)，或兩者都有。廣義的效應(yīng)因子包括PAMP、毒素、降解酶等[3]，其中蛋白類是效應(yīng)因子中的重要組成部分，也稱為效應(yīng)蛋白（effector proteins）[4]。不同物種效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)有差異，如細(xì)菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type Ⅲsecretion system，T3SS）分泌效應(yīng)蛋白[5-6]，卵菌的效應(yīng)蛋白含有RXLR 結(jié)構(gòu)域[7]等。

真菌效應(yīng)蛋白的特點(diǎn)是：①無典型的結(jié)構(gòu)域。雖然有些研究發(fā)現(xiàn)部分效應(yīng)蛋白有2 個(gè)或多個(gè)亮氨酸，以形成如二硫鍵這類結(jié)構(gòu)，但整體來說，真菌效應(yīng)蛋白沒有共有的結(jié)構(gòu)特征[8]，效應(yīng)蛋白之間及其與其他蛋白間的相似性均不高，因此在進(jìn)行預(yù)測時(shí)常與Swiss-prot 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast 比對(duì)，無顯著相似結(jié)構(gòu)蛋白作為潛在效應(yīng)蛋白的條件之一。②屬于胞外分泌蛋白。蛋白分泌至細(xì)胞外主要有2 條途徑，一是經(jīng)典途徑，通過蛋白質(zhì)N 端信號(hào)肽序列將其引導(dǎo)分泌至胞外，約90%的分泌蛋白通過這種途徑分泌至胞外[9]；另一條是非經(jīng)典途徑，少數(shù)分泌蛋白通過該途徑分泌至胞外[10]。在進(jìn)行效應(yīng)蛋白預(yù)測時(shí)經(jīng)?？紤]的是經(jīng)典途徑分泌的蛋白，主要通過蛋白N 端信號(hào)肽來預(yù)測分泌蛋白。

有多款軟件可進(jìn)行分泌蛋白的預(yù)測，每款軟件的預(yù)測方法及功能各有側(cè)重，Caccia等[11]對(duì)這些軟件及其作用進(jìn)行了總結(jié)。將各軟件按照預(yù)測的結(jié)果來分類，可分為如下幾類：①蛋白信號(hào)肽及其剪切位點(diǎn)預(yù)測，常見的預(yù)測軟件如SignalP[12]，其他功能類似的軟件有PrediSI[13]、SigCleave[11]、SpScan[11]、Phobius[14-15]、Philius[16]、RPSP[17]等；②非經(jīng)典途徑分泌蛋白預(yù)測，常見的預(yù)測軟件如SecretomeP[18]，其他功能類似的軟件有SOSUI-GramN[19]，NClassG+[20]等；③蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測，常見的如ProtComp[11]、TargetP[21]、WoLF PSORT[22]，其他有ChloroP[23]等；④跨膜蛋白預(yù)測，常見的預(yù)測軟件有TMHMM[24]、TMpred[25]。

對(duì)分泌蛋白的預(yù)測使用一款軟件如SignalP[26]或者WoLF PSORT[27]，或者聯(lián)合使用多款軟件，多款軟件有不同的組合形式[28-33]。

綜合已有文獻(xiàn)報(bào)道的分泌蛋白軟件預(yù)測使用情況，結(jié)合效應(yīng)蛋白的特征，本研究擬用Perl語言整合SignalP4.1、ProtComp、TargetP1.1、TMHMM2.0、WoLF POSRT等5款軟件進(jìn)行真菌效應(yīng)蛋白預(yù)測。

1 材料和方法

1.1 測試數(shù)據(jù)來源

香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cubense race 1）為鐮刀菌屬的真菌，基因組大小約50 Mb，其蛋白質(zhì)組包含15438 條蛋白序列（BioProject Accession：PRJNA174274），在NCBI 下載這些蛋白序列進(jìn)行測試。

1.2 真菌潛在效應(yīng)蛋白確定

本文將無典型結(jié)構(gòu)域的胞外分泌蛋白定義為潛在的真菌效應(yīng)蛋白。

真菌效應(yīng)蛋白無典型結(jié)構(gòu)域，大多數(shù)效應(yīng)蛋白的功能未知。在NCBI中登錄的蛋白，其功能有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的，將其實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果列出；暫未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的，會(huì)通過nr、Swiss-prot、KEGG、interpro、COG 等數(shù)據(jù)庫的blast 搜索，根據(jù)相似蛋白的功能來推測未知蛋白的功能（即蛋白注釋）；其中功能既無實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果又與其他數(shù)據(jù)庫蛋白無顯著相似性的蛋白常被命名為“hypothetical protein（預(yù)測蛋白，其功能未知）”。根據(jù)這種特點(diǎn)，本文擬通過名稱中出現(xiàn)的“hypothetical protein”這一名詞區(qū)分與其他蛋白無顯著相似性的蛋白，這樣無須進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)庫的blast 搜索（蛋白注釋過程也完成這一步，因此可省略）。對(duì)于研究者自行測序的新物種，先對(duì)所預(yù)測蛋白進(jìn)行注釋，注釋完的數(shù)據(jù)也可利用本文提供的方法進(jìn)行后續(xù)分析。

真菌效應(yīng)蛋白為分泌蛋白，這類蛋白含有信號(hào)肽序列，定位于細(xì)胞外，并非跨膜蛋白。通過軟件SignalP 預(yù)測蛋白N 端含有信號(hào)肽序列，通過3 款亞細(xì)胞定位軟件ProtComp、TargetP、WoLF PSORT預(yù)測蛋白均定位于胞外，通過軟件TMHMM 預(yù)測不是跨膜蛋白。

1.3 預(yù)測軟件介紹

信號(hào)肽預(yù)測軟件SignalP4.1。通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法進(jìn)行N 端信號(hào)肽及其剪切位點(diǎn)預(yù)測，包含5 個(gè)得分參數(shù)，即C值（剪切位點(diǎn)原始分值）、S值（信號(hào)肽序列分值）、Y 值（C 值幾何均值與S 值的聯(lián)合得分值）、mean S（S 值的算術(shù)均值）、D 值（mean S 值與最大Y值的權(quán)重均值）。其中D 值用于區(qū)分信號(hào)肽（SP=‘YES’）與非信號(hào)肽（SP=‘NO’）。本研究使用參數(shù)D值“YES”，預(yù)測蛋白含有N 端信號(hào)肽序列。SignalP是應(yīng)用最廣泛的預(yù)測軟件之一，Choi 等[26]測試發(fā)現(xiàn)其對(duì)分泌蛋白的預(yù)測準(zhǔn)確性達(dá)89%，因此可單獨(dú)用于蛋白分泌組預(yù)測。安裝軟件版本signalp-4.1c.Linux.tar.gz（下載地址：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。

亞細(xì)胞定位預(yù)測軟件ProtComp?？深A(yù)測蛋白定位于何種細(xì)胞器或區(qū)域，如Nuclear（核）、Plasma membrane（質(zhì)膜）、Extracellular（胞外）、Cytoplasmic（細(xì)胞質(zhì)）、Mitochondrial（線粒體）、Endoplasm.retic.（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）、Peroxisomal（過氧化物酶體）、Lysosomal（溶酶體）、Golgi（高爾基體）、Vacuolar（液泡）。該軟件使用5 種預(yù)測方法，即LocDB（與已知定位蛋白同源比對(duì)）、PotLocDB（與理論分析定位蛋白同源比對(duì)）、NNets（神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法）、Pentamers（查詢序列與數(shù)據(jù)庫序列的pentamers 分布比較法）和Integral（將上述4 種方法分值進(jìn)行最終網(wǎng)絡(luò)法整合），預(yù)測結(jié)果供研究者自行判斷。本研究選用Integral 值“Extracellular”預(yù)測蛋白定位于胞外。安裝軟件版本protcompan.tar.bz2（下載地址：http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=index&group=programs&subgroup=proloc）。

亞細(xì)胞定位預(yù)測軟件TargetP1.1。依據(jù)N 端的一定序列長度預(yù)測真核生物蛋白質(zhì)定位（Loc）于葉綠體（C，含葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽cTP）、線粒體（M，含線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽mTP）、含信號(hào)肽分泌蛋白（S，含信號(hào)肽序列SP），或者其他地方（-）。通過預(yù)測的最高值與第二高值之間的差異分值（diff）進(jìn)行可信度分區(qū)，1 代表diff＞0.8，2 代表0.8＞diff＞0.6，3 代表0.6＞diff＞0.4，4 代表0.4＞diff＞0.2，5代表diff＜0.2。本研究使用參數(shù)Loc值“S”，預(yù)測蛋白含信號(hào)肽序列并分泌至胞外。安裝軟件版本targetp-1.1b.Linux.tar.Z（下載地址：http://signalfind.org/tatfind.html）。

亞細(xì)胞定位軟件WoLF PSORT?？深A(yù)測蛋白定位于extr（extracellular，胞外）、cysk（cytoskeleton，細(xì)胞骨架）、E.R.（endoplasmic reticulum，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）、golg（Golgi apparatus，高爾基體）、mito（mitochondria，線粒體）、nucl（nucleus，細(xì)胞核）、plas（plasma membrane，細(xì)胞膜）、pero（peroxisome，過氧化物酶體）、vacu（vacuolar membrane，液泡膜）、chlo（chloroplast，葉綠體）、lyso（lysozyme，溶酶體），并對(duì)可能的定位情況進(jìn)行打分，分值越高定位于該處的可能性越高。本研究使用extr 值＞17，預(yù)測蛋白定位于胞外。O'Connell等[27]發(fā)現(xiàn)其對(duì)胞外分泌蛋白預(yù)測準(zhǔn)確性達(dá)92.7%，因此單獨(dú)用其進(jìn)行真菌分泌組蛋白預(yù)測。安裝軟件版本W(wǎng)oLFPSORT_package_v0.2（下載地址：http://wolfpsort.org/）。

跨膜蛋白預(yù)測軟件TMHMM2.0。預(yù)測蛋白跨膜螺旋的數(shù)量（Number of predicted TMHs，PredHel）和跨膜區(qū)氨基酸長度（Exp number of AAs in TMHs，ExpAA），同時(shí)給出查詢蛋白長度值（len）、前60 個(gè)氨基酸所預(yù)測跨膜螺旋數(shù)（First60）、及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（Topology）等參數(shù)。ExpAA 長度大于18 則證明有跨膜結(jié)構(gòu)或者有信號(hào)肽。本研究使用參數(shù)ExpAA值＜18，預(yù)測蛋白不是跨膜蛋白。安裝軟件版本tmhmm-2.0.Linux.tar.gz（下載地址：http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）。

所使用電腦為Dell 工作站T5600，內(nèi)存32G，操作系統(tǒng)CentOS6.5，系統(tǒng)自帶的Perl 版本5.10.1，所有軟件的安裝根據(jù)相關(guān)軟件說明進(jìn)行，安裝完畢將相關(guān)命令輸出至環(huán)境變量，保證該命令可直接調(diào)用。

相關(guān)軟件及其參數(shù)見表1。

1.4 使用Perl語言進(jìn)行軟件整合

1.4.1 方法一：讓各軟件對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行平行預(yù)測再取結(jié)果交集 將蛋白質(zhì)組分為各個(gè)蛋白質(zhì)后，每一款軟件都對(duì)任一蛋白進(jìn)行預(yù)測，各軟件的排列順序?qū)υ摲椒ㄗ罱K運(yùn)行時(shí)間及最終預(yù)測結(jié)果均無影響（圖1）。用該方法可獲得每一款軟件對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)組完整的預(yù)測結(jié)果（*.signalp.out、*.protcomp.out、*.targetp.out、*.tmhmm.out、*.wolfpsort.out）及最后的各軟件預(yù)測結(jié)果的交集，即潛在的效應(yīng)蛋白（*.effector.list、*.effector.fa、*.effector.info），其中*.effector.list 文件存放的是潛在效應(yīng)蛋白名稱清單，*.effector.fa 文件存放fasta格式的潛在效應(yīng)蛋白序列，*.effector.info文件存放的是5 款軟件對(duì)各潛在效應(yīng)蛋白預(yù)測結(jié)果的匯總。此方法的優(yōu)點(diǎn)是可獲得所有軟件預(yù)測結(jié)果，缺點(diǎn)是運(yùn)行時(shí)間明顯延長。

1.4.2 方法二：讓各軟件按順序進(jìn)行預(yù)測，邊運(yùn)行邊取交集 將蛋白質(zhì)組分為各個(gè)蛋白質(zhì)后，讓各軟件按順序?qū)λ「鞯鞍走M(jìn)行預(yù)測，邊預(yù)測邊取前面各軟件預(yù)測結(jié)果的交集，如果其中任一款預(yù)測軟件所預(yù)測結(jié)果不符合參數(shù)設(shè)定，則終止其后的軟件對(duì)該蛋白的進(jìn)一步預(yù)測分項(xiàng)，這樣可快速獲得最終的交集結(jié)果（圖2），其中*.signalp.final.out、*.protcomp.out、*.targetp.out、*.tmhmm.out、*.wolfpsort.out 這5 個(gè)文件存放的是各軟件對(duì)潛在效應(yīng)蛋白的預(yù)測結(jié)果，這些結(jié)果與方法一的結(jié)果的區(qū)別是：前者保存的各軟件對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)組完整的預(yù)測結(jié)果，后者保存的是各軟件對(duì)最終潛在效應(yīng)蛋白的預(yù)測結(jié)果。*.effector.list、*.effector.fa、*.effector.info 這3 個(gè)文件存放的內(nèi)容與方法一同名文件存放相同的內(nèi)容（表2）。在相關(guān)軟件的順序安排上，由于各軟件運(yùn)行速度有差異，會(huì)導(dǎo)致最終運(yùn)行時(shí)間的差異，因此將運(yùn)行速度快的軟件或方法盡可能排在前面（表2），由于SignalP是預(yù)測信號(hào)肽蛋白最準(zhǔn)確，也是目前預(yù)測分泌蛋白使用最多的軟件，因此將其排列在除Linux系統(tǒng)命令之外的其他各軟件之前，WoLF PSORT 是另一款可單獨(dú)用于分泌蛋白預(yù)測的軟件，將其放在最后，這樣最終軟件排列順序依次為Linux 系統(tǒng)命令、SignalP、ProtComp、TMHMM、TargetP、WoLF PSORT。

圖1 方法一預(yù)測流程圖（各軟件平行預(yù)測）

2 結(jié)果與討論

用香蕉枯萎病菌蛋白質(zhì)組（共有蛋白序列15438 seqs）進(jìn)行2 種方法的測試，2 種方法均可預(yù)測最終潛在效應(yīng)蛋白348 seqs。

圖2 方法二預(yù)測流程圖（各軟件先后預(yù)測）

方法一在獲得最終潛在效應(yīng)蛋白的同時(shí)，可以獲得其他軟件單獨(dú)運(yùn)行的結(jié)果，預(yù)測流程及結(jié)果見圖1，預(yù)測過程耗時(shí)8 h 25 min。具體結(jié)果如下：①用Linux 命令找出“hypothetical protein”7672 seqs；②用SignalP 軟件預(yù)測含信號(hào)肽的蛋白1494 seqs；③用ProtComp 軟件預(yù)測胞外分泌蛋白1668 seqs；④用TMHMM 軟件預(yù)測非跨膜蛋白12387 seqs；⑤用TargetP 軟件預(yù)測胞外蛋白2595 seqs；⑥用WoLF PSORT 軟件預(yù)測胞外蛋白1027 seqs；⑦各軟件預(yù)測結(jié)果交集即為最終潛在效應(yīng)蛋白348 seqs。

方法二進(jìn)行各軟件的先后順序預(yù)測，前一款軟件預(yù)測結(jié)果不符合參數(shù)設(shè)置則不再進(jìn)行后續(xù)軟件的預(yù)測，對(duì)香蕉枯萎病菌蛋白質(zhì)組15438 seqs 進(jìn)行預(yù)測，流程圖見圖2，整個(gè)過程耗時(shí)40 min，相對(duì)于方法一大大縮短了預(yù)測時(shí)間，而所預(yù)測的最終潛在效應(yīng)蛋白一致（348 seqs）。預(yù)測過程是這樣的：①首先用Linux 命令找出其中的“hypothetical protein”7672 seqs，去掉非“hypothetical protein”7766 seqs；②然后用SignalP 軟件預(yù)測“hypothetical protein”7672 seqs 中含信號(hào)肽序列的蛋白828 seqs，去掉不含信號(hào)肽序列的蛋白6844 seqs；③用ProtComp 軟件預(yù)測828 seqs 中定位于胞外的蛋白539 seqs，去掉定位于其他地方的蛋白289 seqs；④用TMHMM 軟件預(yù)測539 seqs 中不含跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白505 seqs，去掉含跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白34 seq；⑤用TargetP 軟件預(yù)測505 seqs 中定位與胞外的蛋白501 seqs，去掉定位于其他地方的蛋白4 seqs；⑥最后用WoLF PSORT 軟件預(yù)測501 seqs 中定位于胞外的蛋白348 seqs，去掉153 seqs，這樣獲得最終潛在效應(yīng)蛋白348 seqs。

由于真菌經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的效應(yīng)蛋白太少，無法進(jìn)行本方法的準(zhǔn)確性測試，但是通過比較現(xiàn)有的蛋白分泌組所使用的方法[28-33]，本方法與其類似；O'Connell 等[27]通過blast 比對(duì)及單獨(dú)使用WoLF PSORT 進(jìn)行2 種炭疽病菌的潛在效應(yīng)蛋白預(yù)測，結(jié)果分別為177（禾生炭疽菌，Colletotrichum graminicola）和365 seqs（白菜炭疽菌，C.higginsianum），與本方法的預(yù)測結(jié)果處于同一數(shù)量級(jí)。

表2 2種方法運(yùn)行結(jié)果比較表

綜上，我們整合5 款軟件建立了真菌效應(yīng)蛋白的2 種預(yù)測方法，方法一在獲得最終潛在效應(yīng)蛋白的同時(shí)，可獲得各軟件單獨(dú)的預(yù)測結(jié)果，但耗時(shí)長；方法二可快速獲得最終潛在效應(yīng)蛋白預(yù)測結(jié)果。2種方法均可用于真菌效應(yīng)蛋白預(yù)測，可由研究者選擇使用（2種方法的Perl程序附在文后）。

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附件1：方法一所用Perl程序

附件2：方法二所用Perl程序