曹 歡 景宏麗 王 姝 王靜波 王小亮 徐立蒲

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IHNV單克隆抗體的制備及其初步應(yīng)用

曹 歡1景宏麗2王 姝1 王靜波1 王小亮1 徐立蒲1

(1. 北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站, 北京100021; 2. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動物檢驗檢疫研究所, 北京100029)

傳染性造血器官壞死病毒; 單克隆抗體; 雙抗體夾心ELISA法

傳染性造血器官壞死(Infectious haematopoietic necrosis, IHN) 是嚴(yán)重危害我國鮭、鱒魚苗種業(yè)的一種病毒性疾病。主要感染虹鱒、硬頭鱒等冷水魚類, 急性感染時累計死亡率可達(dá)95%以上[1, 2], 并可垂直傳播給子代。IHN被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須申報的動物疫病, 被我國列為二類動物疫病。該病最早流行于北美和歐洲一些國家, 目前已經(jīng)蔓延至我國遼寧、河北、甘肅等主要冷水魚養(yǎng)殖地區(qū), 并造成較大經(jīng)濟(jì)損失[3, 4]。

該病的病原是傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus, IHNV), 屬彈狀病毒科(), 粒外彈狀病毒屬()。目前我國對IHNV檢測方法的研究相對落后, 主要集中在檢測病毒核酸的PCR方法[5, 6], 由于缺乏IHNV的相應(yīng)抗體, 免疫學(xué)診斷技術(shù)的研究比較缺乏。本研究旨在制備抗傳染性造血器官壞死病毒的特異性單克隆抗體, 以期研制出特異、靈敏、快速、大通量的病毒檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

傳染性造血器官壞死病毒(IHNV-UK)由英國Weymouth的OIE參考實驗室贈送給中國檢驗檢疫科學(xué)研究院水生動物檢疫實驗室江育林研究員并惠贈給本實驗室。實驗用魚類細(xì)胞系及病毒株均由本實驗室保藏, BALB/c小白鼠購自北京軍事科學(xué)與醫(yī)學(xué)研究院。RPMI 1640 購自HYCLONE公司, 特級胎牛血清購自杭州四季青公司, HAT、HT、聚乙二醇(PEG1500)購自GIBCO公司, 二甲基亞砜購自上海生物公司, 辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠Ig、硫酸鹽(TMB)、弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自SIGMA公司, 羊抗鼠IgG亞類檢測試劑盒購自Southern Biotech公司, CKX41倒置相差顯微鏡為OLYMPUS公司產(chǎn)品, 二氧化碳培養(yǎng)箱為SANYO公司產(chǎn)品; Avanti J-30I 超速離心機(jī)為BECKMAN公司產(chǎn)品。其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 抗原的制備及動物免疫

培養(yǎng)鯉上皮瘤細(xì)胞(EPC), 傳代16—24h內(nèi)接種IHNV-UK, 加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液置于17.5℃培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生90%病變(CPE)之后凍融1次, 收集病毒液。8000 r/min離心30min, 收集的上清再24000 r/min離心2h以沉淀病毒, 沉淀用適量0.01 mol/L PBS重懸。免疫BALB/c小鼠, 共免疫5次, 首次免疫為病毒加等量弗氏完全佐劑, 第2次免疫為病毒加等量弗氏不完全佐劑, 其余各次免疫僅用全病毒, 免疫劑量為每次0.1 mL純病毒(約15 mg/mL), 免疫途徑為腹腔注射。

1.3 細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選

按照常規(guī)方法[7]進(jìn)行細(xì)胞融合, 陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選參照文獻(xiàn)[8]中的間接ELISA方法, 不同的是包被抗原用提純的IHNV-UK, 包被抗原濃度為15 mg/L。用羊抗IHNV血清的稀釋度通過做方陣滴定試驗決定。

1.4 陽性雜交瘤細(xì)胞株的建立及腹水的制備

將鑒定為陽性的細(xì)胞孔中的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng), 并及時凍存, 同時按照有限稀釋法進(jìn)行亞克隆, 至雜交瘤細(xì)胞孔抗體陽性率為100%時, 即可定株。按照常規(guī)方法[8]進(jìn)行小鼠腹水的制備。

1.5 單克隆抗體特性鑒定

mAb效價測定收集雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液及腹水, 以2倍比進(jìn)行稀釋, 用間接ELISA法測定效價。

mAb的亞類鑒定按照SouthernBiotech單抗分型試劑盒介紹的方法進(jìn)行亞類鑒定。

Werstern-blot分析按常規(guī)方法[9]將純化的病毒進(jìn)行SDS-PAGE和Werstern-blot, 濃縮膠為5%, 分離膠為12%。一抗為制備的腹水單抗(1∶500)二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5000), DAB顯色。

中和活性的測定將腹水從1∶20起做倍比稀釋至1︰2560, 將病毒20050/100 mL與各稀釋度腹水等體積混合, 25℃感作1h , 然后接種到新鮮制備的單層EPC細(xì)胞上, 每天觀察細(xì)胞病變, 連續(xù)觀察7d, 按Reed-Muench法計算單抗的中和效價。

1.6 mAb雙夾心ELISA法的建立

mAb雙夾心ELISA法操作步驟用2.5 μg/mL羊抗IHNV多抗包板4℃過夜, 100 μL/孔。PBST洗3遍; 加1︰10的魚組織勻漿上清液, 并設(shè)陽性、陰性對照, 100 μL/孔。37℃ 1h, PBST洗3遍; 加單抗 1B10, 100 μL/孔, 37℃ 1h, PBST洗2遍; 加0.1% H2O2, 300 μL/孔, 37℃ 15min, PBST洗2遍; 加羊抗鼠IgG-HRP, 100 μL/孔, 37℃ 1h, PBST洗3遍; 加顯色液(TMB+H2O2) 100 μL/孔, 室溫避光作用5—10min, 用2 mol/L H2SO4溶液終止, 150 μL/孔, 測定OD450。當(dāng)樣品的OD值＞陰性O(shè)D值的平均值+3SD時, 判定為陽性。

mAb雙夾心ELISA法的特異性以5種魚類病毒和8株魚類細(xì)胞為樣品, 用建立的mAb雙夾心ELISA法進(jìn)行檢測。

mAb雙夾心ELISA法的靈敏度純化的IHNV病毒(5.4 mg/mL)以10倍比稀釋, 未純化的病毒 (105.550/100 μL)以2倍比稀釋; 病毒接種EPC細(xì)胞, 每24h取樣, 用建立的mAb雙夾心ELISA法進(jìn)行檢測。

1.7 mAb雙夾心ELISA法的應(yīng)用

對分離株的測定取9個IHNV分離株, 用建立的mAb雙夾心ELISA法進(jìn)行檢測, 同時采用Karber法計算50[10]。

對樣品的測定隨機(jī)抽取43份盲樣(每個樣品不少于15尾魚), 取肝、腦、脾、腎組織勻漿后, 用0.01 mol/L PBS 1︰10稀釋制成混懸液, 離心取上清, 用建立的mAb雙夾心ELISA法進(jìn)行檢測。同時, 采用細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒和PCR鑒定的方法對樣品進(jìn)行平行檢測, 比較兩種方法的一致程度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞融合

在細(xì)胞融合后, 經(jīng)含HAT的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選, 產(chǎn)生100多個雜交瘤細(xì)胞, 用建立的間接ELISA法篩選, 陽性孔經(jīng)3次克隆純化后, 最終得到1株可高效、穩(wěn)定分泌抗IHNV-UK抗體的雜交瘤細(xì)胞株, 命名為1B10。

2.2 mAb1B10的生物學(xué)特性

間接ELISA法測得細(xì)胞上清的抗IHNV效價在1︰160以上, 腹水的抗IHNV效價在1︰2.5×105以上。中和試驗結(jié)果顯示, mAb 1B10沒有中和IHNV的能力?？贵w亞類鑒定結(jié)果顯示, mAb 1B10為IgG1亞類, 輕鏈為Kappa鏈。采用SDS-PAGE和Western-blot方法測定, mAb 1B10針對的抗原決定簇位點位于IHNV-UK的相對分子量(Mt)42000的蛋白條帶上。推斷該蛋白為IHNV核蛋白, 該結(jié)果與文獻(xiàn)[11]報道一致, 趙永欣等[12]表達(dá)了IHNV- ZYX的核蛋白大小約48 kD, 與本文推斷基本相符。

2.3 mAb雙夾心ELISA法的特異性

用建立的mAb雙夾心ELISA法測定5種病毒和8種魚類細(xì)胞的OD值, 結(jié)果顯示, 僅IHNV-UK呈陽性反應(yīng), 而其他5種病毒和8種魚類細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。

2.4 mAb雙夾心ELISA法的靈敏度測定

將提純的IHNV-UK按1︰10的稀釋度作倍比稀釋后用建立的mAb雙夾心ELISA法檢測, 最低檢出限為540 ng/mL; 將病毒懸液按1︰2稀釋度作倍比稀釋后用建立的mAb雙夾心ELISA法檢測, 檢測靈敏度達(dá)到1︰64 (活病毒量為103.750/100 μL); 將病毒接種EPC細(xì)胞, 每24h取樣用建立的mAb雙夾心ELISA法檢測, 在EPC細(xì)胞接種病毒72h后即可在細(xì)胞中檢測到病毒。

2.5 mAb雙夾心ELISA法的初步應(yīng)用

對各地分離到的毒株的檢測用建立的mAb雙夾心ELISA法對9份來源于不同地區(qū)的IHNV毒株以及IHNV-UK進(jìn)行檢測(表5)。提示該方法的特異性能夠覆蓋分離到的各個IHNV毒株, 但是病毒量和OD值之間并無相關(guān)關(guān)系。編號為13071的樣品OD平均值最高為0.527, 編號為12096的樣品OD平均值最低為0.259。

表1 mAb雙夾心ELISA法特異性檢測結(jié)果

Tab. 1 The reaction of double antibodies sandwich ELISA against fish viruses and cell lines (±S, n=2)

表1 mAb雙夾心ELISA法特異性檢測結(jié)果

病毒及細(xì)胞系Fish viruses and cell linesA450檢測結(jié)果Results 病毒 Fish viruses IHNV-UK0.275±0.016+ 病毒性出血敗血癥病毒(Viral Hemorrhagic Septicemia virus, VHSV)0.066±0.001– 鯉春血癥病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV)0.069±0.000– 草魚出血病病毒(Grass carp reovirus, GCRV)0.069±0.001– 傳染性胰臟壞死病病毒(Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)0.068±0.001– 流行性造血器官壞死病病毒(Epizootic haematopoietic necrosis virus, EHNV)0.068±0.000– 細(xì)胞系 Cell lines 胖頭鱥肌肉細(xì)胞系(Fathead monnow cell line, FHM)0.070±0.000– 虹鱒肝細(xì)胞系(Rainbow trout liver cell line, R1)0.068±0.001– 草魚腎細(xì)胞系(Grass carp kidney cell line, CIK)0.072±0.004– 草魚卵巢細(xì)胞系(Grass carp ovary cell line, CO)0.072±0.001– 藍(lán)鰓太陽魚細(xì)胞系(Bluegill fry cell line, BF-2)0.069±0.000– 虹鱒性腺細(xì)胞系(Rainbow trout gonad cell line, RTG-2)0.074±0.001– 鯉上皮瘤細(xì)胞系(Epithelioma papulosum cyprini cell line, EPC)0.070±0.003– 大鱗大麻哈魚胚胎細(xì)胞系(Chinook salmon embryo cell line, CHSE)0.065±0.000– 陰性對照 Negative control0.069±0.002–

表2 純化病毒的檢測靈敏度

Tab. 2 The result of sensitivity test by purified IHNV (±S, n=2)

表2 純化病毒的檢測靈敏度

病毒量Quantity (ng/mL)A450檢測結(jié)果 Result 5400001.23±0.13+ 540001.18±0.21+ 54000.27±0.07+ 5400.15±0.03+ 540.084±0.02– 5.40.077±0.02–

表3 病毒培養(yǎng)液的檢測靈敏度

Tab. 3 The result of sensitivity test by cell cultured IHNV (±S, n=2)

表3 病毒培養(yǎng)液的檢測靈敏度

稀釋度DilutionA450檢測結(jié)果Result 1︰40.213±0.008+ 1︰80.215±0.010+ 1︰160.169±0.001+ 1︰320.121±0.010+ 1︰640.092±0.009+ 1︰1280.080±0.006– 1︰2560.071±0.006–

表4 不同病毒分離時間的檢測靈敏度

Tab. 4 The result of sensitivity test by cell cultured IHNV which was harvested at 24h intervals after infection (±S, n=2)

表4 不同病毒分離時間的檢測靈敏度

培養(yǎng)時間Cultured time (h)A450檢測結(jié)果Result 240.071±0.007– 480.087±0.003– 720.096±0.001+ 960.144±0.008+ 1200.362±0.054+ 1440.331±0.007+

對樣品的檢測對43份樣品按OIE規(guī)定的方法, 取魚的肝、腦、脾、腎混合制樣, 用mAb雙夾心ELISA法和病毒分離方法同時進(jìn)行檢測, 以進(jìn)行比較。和黃金方法相比, ELISA方法在特異性上的符合率達(dá)到93.9% (31/33), 在靈敏度上的符合率達(dá)到80.0%(8/10); 建立mAb雙夾心ELISA法與病毒分離方法檢測結(jié)果的符合率為90.7% (39/43)。

3 討論

IHNV作為制約鮭、鱒養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要病原, 其危害已引起了廣泛的關(guān)注。由于病毒病尚無有效的治療方法, 病原的早期、快速檢測對疾病的控制至關(guān)重要。目前OIE推薦的諸多診斷方法[13]中, 病毒分離、中和試驗等傳統(tǒng)的病毒檢測方法費時、費力; PCR、核酸探針等新型技術(shù)時效性較好, 但假陽性率較高。而ELISA檢測方法具有快速、準(zhǔn)確、高通量等特點, 是OIE和許多國外獸醫(yī)機(jī)構(gòu)認(rèn)可的魚類病毒病診斷鑒別方法, 在多個國家得到了普遍應(yīng)用, 并且取得了良好效果[14—17]。國內(nèi)由于受到抗體來源的限制, 免疫學(xué)技術(shù)方面的研究比較缺乏。國內(nèi)學(xué)者先后表達(dá)出了IHNV的糖蛋白和核衣殼蛋白, 并制備了抗IHNV糖蛋白的多抗血清[12, 18, 19]。但是由于表達(dá)蛋白的免疫原性不穩(wěn)定、彈狀病毒之間抗原性比較相似等原因, 制備的抗體難以滿足IHNV檢測的特異性要求。本研究以差速離心純化的全病毒作為抗原免疫小鼠, 成功制備了效價在1︰2.5×105以上, 能夠特異性結(jié)合IHNV-UK核蛋白的mAb 1B10; 將其應(yīng)用到ELISA檢測中, 可與IHNV發(fā)生反應(yīng), 而不與SVCV、VHSV等5種病毒和8種魚類細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)。檢測的特異性覆蓋從北京、青海、甘肅等不同地區(qū)分離到的9個IHNV分離株。該抗體的制備, 為進(jìn)一步研制傳染性造血器官壞死病毒的快速、高通量檢測及流行病學(xué)監(jiān)測提供了檢測試劑。

表5 mAb雙夾心ELISA法對毒株檢測結(jié)果

Tab. 5 The reaction of double antibodies sandwich ELISA against IHNV viruses isolated from Beijing Qinghai and Gansu (±S, n=2)

表5 mAb雙夾心ELISA法對毒株檢測結(jié)果

來源Source甘肅Gansu青海Qinghai北京Beijing英國參考株Reference virus of UK 編號Number120741207513066120961219112196121691307112171INHV-UK A4500.379± 0.0080.391± 0.000.510± 0.0280.259± 0.0060.360± 0.0160.449± 0.0080.437± 0.0030.527± 0.0110.328± 0.0160.335± 0.009 病毒量Quantity (TCID50/100 μL)105.17104. 5105.83104.83105.17105.5104.83105.5104.83104.5

利用mAb 1B10和多克隆羊抗血清建立了檢測IHNV的雙抗體夾心ELISA方法。通過對43份盲樣進(jìn)行檢測, 并與黃金方法進(jìn)行比較和質(zhì)量評估, 證明本研究所建立的mAb雙夾心ELISA診斷方法具有良好的特異性(特異性上的符合率93.9%)。但是幾乎所有的檢測方法, 在特異性與靈敏度之間都存在一定矛盾, 難以同時兼顧。在本項目建立的McAb雙夾心ELISA診斷方法中, 靈敏度相對較低, 這可能與建立的McAb雙夾心ELISA檢測技術(shù)時的檢測限有關(guān)。本項目建立的檢測技術(shù), 可檢測到103.750/100 μL以上的病毒, 但是在病毒隱性感染或發(fā)病初期, 魚體內(nèi)的病毒可能達(dá)不到此數(shù)量, 導(dǎo)致診斷結(jié)果中假陰性的發(fā)生。為克服這一問題, 可以通過加大樣品數(shù)量來彌補(bǔ), 或者先在細(xì)胞中做短期擴(kuò)增后再進(jìn)行檢測。實驗室研究顯示, 將樣品接入細(xì)胞72h后, 再采用本方法檢測, 特異性和靈敏度均可達(dá)到90%以上。本方法的建立能夠滿足傳染性造血器官壞死病毒的大通量、快速檢測需求, 為大規(guī)模篩查該病以及快速篩選帶病魚提供了技術(shù)依托。

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PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST IHNV AND ITS PRELIMINARY APPLICATION

Cao Huan1, Jing Hong-li2, Wang Shu1, Wang Jing-bo1, WangXiao-liang1and Xu Li-pu1

(1. Beijing Fisheries Technical Extension Station, Beijing 100021, China; 2. Research Center of Aquatic Animal Diseases, Institute of Animal Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China)

Infectious haematopoietic necrosis virus; Monoclonal antibody; Double antibodies sandwich ELISA

10.7541/2015.56

S941.4

A

1000-3207(2015)02-0426-05

2014-04-15;

2014-08-14

北京市科委項目(Z111100074311007); 北京市鱘魚、鮭鱒魚創(chuàng)新團(tuán)隊(SCGWZJ 20131104-3)資助

曹歡(1981—), 女, 黑龍江牡丹江人; 碩士; 主要從事水產(chǎn)動物病害防治的研究。E-mail: lsen1980@sina.com

徐立蒲(1972—), 男, 黑龍江人; 博士; 主要從事水產(chǎn)動物病害防治的研究。E-mail: bjybk@163.com