楊 健 劉冬梅 何永吉 漢斯·達(dá)姆斯 王 蘭

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鎘對(duì)河南華溪蟹卵黃磷蛋白在卵巢中表達(dá)含量的影響及ELISA法的建立

楊 健1劉冬梅2何永吉1漢斯·達(dá)姆斯3王 蘭1

(1. 山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 太原 030006; 2. 山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 太原 030006; 3. 高雄醫(yī)學(xué)大學(xué)生命科學(xué)院, 高雄 80708)

為了探究鎘對(duì)河南華溪蟹()的卵子發(fā)生的影響, 通過(guò)凝膠過(guò)濾層析法純化了成熟卵巢中的卵黃磷蛋白(Vitellin, Vn), 采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定了Vn亞基數(shù)量及分子量, 以純化的Vn為抗原制備了Vn多克隆抗血清并建立了可靠的Vn含量測(cè)定的ELISA方法。采用氯化鎘體外亞慢性染毒的方法, 運(yùn)用Vn-ELISA方法檢測(cè)鎘暴露對(duì)卵巢組織中Vn含量的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和5.8 mg/L鎘處理組, 處理時(shí)間分別為10、15和20d。結(jié)果顯示, (1) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明該蛋白由分子量為102、84和70 kD的3個(gè)亞基組成, 同時(shí)Western-blotting檢測(cè)表明, 抗血清對(duì)該蛋白具有較強(qiáng)的免疫特異性; (2) 在Vn-ELISA中, Vn抗體最佳稀釋倍數(shù)為1︰100000, 該方法的工作濃度范圍為125—2000 ng/mL, 定性檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到15.62 ng/mL; 卵巢中Vn含量測(cè)定的結(jié)果中各批次間沒(méi)有顯著差異, 且平均變異系數(shù)分別僅為7.81%, 表示該法具有較高的穩(wěn)定性和重復(fù)性; (3) 鎘引起卵巢組織中Vn含量的顯著降低, 與鎘處理時(shí)間具有時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系, 說(shuō)明了鎘暴露可影響河南華溪蟹卵母細(xì)胞的成熟并對(duì)卵子發(fā)生產(chǎn)生抑制作用, 進(jìn)而影響卵巢的正常發(fā)育。

河南華溪蟹; 卵黃磷蛋白; SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳; 酶聯(lián)免疫吸附法; 鎘

鎘在工業(yè)中的大量使用導(dǎo)致其成為環(huán)境中大量存在的非必需金屬元素之一, 同時(shí)也成為水體污染中一類(lèi)典型的環(huán)境污染物。本實(shí)驗(yàn)室早期研究發(fā)現(xiàn)鎘可以在河南華溪蟹()卵巢、肝胰腺、鰓以及肌肉等組織中富集, 導(dǎo)致生物體產(chǎn)生急性或慢性中毒, 造成組織器官出現(xiàn)不同程度的損害, 如鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[1—4]。韓托等[5]研究發(fā)現(xiàn)在鎘富集的水域生物個(gè)體大量死亡, 這直接導(dǎo)致水生生物種群數(shù)量和生物多樣性顯著降低。此外, 研究發(fā)現(xiàn)鎘會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)、蟹類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)的脂質(zhì)、糖類(lèi)和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生影響, 從而影響物種的遷徙和繁殖[6—8]。同時(shí)由于鎘的半衰期較長(zhǎng), 通過(guò)消化及呼吸系統(tǒng)進(jìn)入機(jī)體后造成的損傷是永久的, 這將會(huì)長(zhǎng)期影響水生環(huán)境中物種的繁殖過(guò)程進(jìn)而影響生物種群及生態(tài)系統(tǒng), 因此探究可反映污染物對(duì)生物早期影響的繁殖參數(shù)是水生生態(tài)毒理學(xué)研究中急需要解決的問(wèn)題。

卵子發(fā)生是甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育中的一個(gè)重要階段, 表現(xiàn)為卵母細(xì)胞中卵黃蛋白原(Vitellogenin, Vg)的形成和積累[9]。在卵巢中, Vg會(huì)通過(guò)進(jìn)一步的修飾和加工形成包含有Vg、脂類(lèi)、碳水化合物和色素等物質(zhì)的卵黃磷蛋白(Vitellin, Vn), 并在卵母細(xì)胞中積累形成卵黃體。Vn是甲殼動(dòng)物卵子存活和胚胎發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來(lái)源, 卵巢中Vn積累的多少直接影響到其后生殖過(guò)程和幼體質(zhì)量。因此, Vn可作為研究甲殼動(dòng)物繁殖的重要生物指標(biāo)[10]。此外, 甲殼動(dòng)物的卵黃發(fā)生過(guò)程由于受內(nèi)分泌系統(tǒng)、外部環(huán)境的調(diào)節(jié)而具有較高的復(fù)雜性, 目前對(duì)其內(nèi)在的調(diào)控機(jī)制研究已成為甲殼動(dòng)物研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一[11, 12]。甲殼動(dòng)物Vn已有的研究發(fā)現(xiàn), Vn含量與卵巢發(fā)育階段具有一定的相關(guān)性, 因此機(jī)體組織中Vn含量測(cè)定對(duì)于研究鎘對(duì)甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生的影響具有重要意義。

酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunoabsor-bent assay, ELISA) 已被廣泛用于甲殼動(dòng)物Vn含量的測(cè)定[13, 14]。不同的甲殼動(dòng)物在Vn亞基數(shù)目、空間結(jié)構(gòu)和分子量上通常存在一定差異, 因此需要針對(duì)不同物種制備具有特異性的Vn抗體, 并在此基礎(chǔ)上建立適合該物種Vn-ELISA方法, 為進(jìn)一步研究甲殼動(dòng)物卵黃發(fā)生及鎘對(duì)卵巢發(fā)育的影響提供重要依據(jù)。目前, 對(duì)于甲殼動(dòng)物卵子發(fā)生和鎘對(duì)卵巢發(fā)育的影響已進(jìn)行了較為廣泛的研究[13—16]。然而河南華溪蟹在這方面的研究少有報(bào)道。因此, 當(dāng)前迫切需要建立一種較為可靠的方法以測(cè)定鎘處理后河南華溪蟹卵巢中Vn含量。本研究分離并純化了河南華溪蟹的Vn, 制備了Vn多克隆抗體, 優(yōu)化了Vn測(cè)定的ELISA參數(shù), 該方法不僅可以用于研究鎘對(duì)河南華溪蟹卵巢中卵子發(fā)生的影響, 還可作為深入研究河南華溪蟹生殖調(diào)控和環(huán)境監(jiān)測(cè)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

河南華溪蟹(簡(jiǎn)稱(chēng)“溪蟹”)于2013年10月購(gòu)自山西省太原市五龍口水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。選取卵巢發(fā)育成熟的雌蟹置于實(shí)驗(yàn)室水族缸中暫養(yǎng)三周后進(jìn)行活體解剖后將卵巢保存于–80℃冰箱中備用。

1.2 卵黃磷蛋白分離和純化

卵巢粗提液的制備溪蟹成熟卵巢中加入10倍體積預(yù)冷的勻漿緩沖液(0.02 mol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L NaCl, 0.01% EDTA, 0.1 mmol/L PMSF)冰浴勻漿, 在4℃12000×下離心30min后取橘黃色上清液并加入等體積的飽和硫酸銨溶液, 冰浴1h后再次在4℃12000×下離心30min, 棄上清液, 向離心管中加入2 mL的PBS緩沖液(0.1 mol/L KH2PO4, 0.1 mol/L Na2HPO4·12H2O, 0.1 mol/L NaCl, 0.1 mol/L KCl, 0.01% EDTA, pH 7.7)溶解沉淀, 然后重復(fù)“沉淀-離心-復(fù)溶”的步驟5次, 最后將沉淀物溶解于1 mL PBS緩沖液中用于凝膠過(guò)濾層析分離純化蛋白。

卵黃磷蛋白提取采用凝膠柱體積為260 mL (直徑×高度=2.6 cm×100 cm, 上海廈美生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)), 裝入220 mL凝膠(型號(hào)SephacrylTMS 100 HR, 瑞典Pharmacia公司生產(chǎn)), 純化前首先采用PBS緩沖液溶液平衡凝膠柱, 流速16 mL/h, 平衡1h。用注射器上樣2 mL Vn提取液, 流速為16 mL/h, 使用UVD-680-3紫外檢測(cè)器(上海金達(dá)生化儀器廠)在280 nm條件下檢測(cè)洗脫液的吸收值。當(dāng)出現(xiàn)蛋白組分時(shí)開(kāi)始收集, 每2 mL收集1管, 洗脫液于–80℃保存?zhèn)溆?。使用SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices分子儀器公司)對(duì)提純后的卵黃蛋白溶液進(jìn)行連續(xù)光譜掃描(700—200 nm)以檢測(cè)類(lèi)胡蘿卜素。

1.3 卵黃磷蛋白亞基數(shù)量及分子量分析

將純化蛋白進(jìn)行變性聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE, 分離膠質(zhì)量濃度為10%, 濃縮膠質(zhì)量濃度為5%), 然后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色后, 在Tanon-2500 (上海天能公司)凝膠成像儀拍照, 通過(guò)與蛋白標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)并采用BandScan 5.0軟件以確定溪蟹Vn各亞基的分子量。

1.4 抗體制備和免疫印跡

選用6—8周齡雌性BALB/c小鼠作為免疫動(dòng)物, 暫養(yǎng)1周后將純化的Vn溶液與QuickAntibody等體積混合后用于免疫注射。每只小鼠于后腿小腿肌肉首次免疫注射100 μL (免疫抗原量25 μg)的抗原乳化液, 此后第21天再次注射100 μL抗原乳化液進(jìn)行加強(qiáng)免疫, 第35天小鼠摘除眼球取血, 室溫靜置1h待血液凝固后, 于4℃12000×離心10min后取上清, 加入0.02% NaN3, 無(wú)菌分裝于–80℃。

采用蛋白免疫印跡(Western-Blotting)檢驗(yàn)抗體和抗原免疫反應(yīng)的特異性。首先將純化的Vn進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 電泳條件同前。電泳結(jié)束后的凝膠在72 V電壓下轉(zhuǎn)膜1h。將鼠多克隆抗體按 1︰5000稀釋, 加樣體積為1 mL, 室溫孵育1h; 加入1︰2000稀釋的羊抗鼠IgG-IRP(Catalog No. HSA0004, 上海麥約爾生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))作為二抗, 室溫孵育1h后用1 mL PBST (10 mmol/L PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.2)洗滌3次, 每次10min; 采用DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒(德國(guó)Roche公司)顯色3min后采用Tanon-2500凝膠成像儀拍照。

1.5 Vn抗體效價(jià)檢測(cè)和Vn-ELISA建立

采用間接包被法ELISA確定鼠多克隆Vn抗體的有效稀釋倍數(shù)并建立Vn-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。主要包括抗原包被、封閉、加抗體、顯色、反應(yīng)終止和讀數(shù)等步驟。(1)包被: 將純化的Vn用包被緩沖液(0.05 mol/L Na2CO3, 0.05 mol/L NaHCO3, pH=9. 6)溶解成1 μg/mL, 然后按每孔100 μL進(jìn)行包被, 4℃過(guò)夜后去除包被液; (2)封閉: 用200 μL的PBST重復(fù)清洗3次后, 每孔加入200 μL的封閉液(1%牛血清白蛋白)封閉2h, 然后用PBST洗滌3次; (3)加抗體: 將純化后的Vn抗血清按1︰1000、1︰10000、1︰100000和1︰20000用1%的BSA進(jìn)行稀釋, 每孔加樣100 μL, 同時(shí)以不含Vn抗體的1% BSA為陰性對(duì)照, 37℃反應(yīng)2h, 每孔用200 μL PBST洗滌3次后加100 μL稀釋的羊抗鼠IgG-HRP作為二抗, 37℃放置1h后用PBST洗滌3次; (4)顯色: 加入100 μL TMB顯色液(北京索萊寶科技有限公司), 室溫避光放置30min; (5)反應(yīng)終止: 加50 μL終止液(2 mol/L H2SO4溶液); (6)讀數(shù): 采用SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的吸光度。

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制備, Vn稀釋液的質(zhì)量濃度分別為7.81、15.62、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000和4000 ng/mL, 每個(gè)質(zhì)量濃度組各重復(fù)3孔, 同時(shí)設(shè)置3個(gè)陰性對(duì)照, 在酶標(biāo)儀上讀取450。根據(jù)線性關(guān)系和變異系數(shù), 選取具有良好重復(fù)性和質(zhì)量濃度相關(guān)性的Vn濃度范圍繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選擇5只雌性溪蟹, 分別稱(chēng)重0. 1 g左右的卵巢組織, 加入10倍體積預(yù)冷的勻漿緩沖液進(jìn)行勻漿, 將勻漿液在4℃、12000×下離心15min, 取上清液0.1 mL用于ELISA測(cè)定。將勻漿液用包被緩沖液稀釋后用于ELISA測(cè)定; 該實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次, 然后分析批次間的誤差及變異系數(shù), 從而驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)建立ELISA方法的可靠性和穩(wěn)定性。

1.7 樣本染毒處理

選取處于卵巢發(fā)育期的成年雌性溪蟹進(jìn)行染毒處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和5.8 mg/L鎘染毒組, 體外暴露10、15 和20d后取樣。各染毒時(shí)間組隨機(jī)選取5只溪蟹迅速解剖, 取出卵巢組織后采用Vn- ELISA法以測(cè)定其Vn含量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立的重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。分別采用Kolmogorov-Smirnov和Levene法進(jìn)行數(shù)據(jù)分布和方差齊性檢驗(yàn), 采用單因素方差分析中的Dunnett’s post-hoc 法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。采用Test (independent samples Test)比較不同Vn抗體稀釋倍數(shù)、不同Vn質(zhì)量濃度和不同測(cè)定批次對(duì)結(jié)果是否存在顯著差異, LSD法進(jìn)行染毒組與對(duì)照組兩兩比較, 以<0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 河南華溪蟹Vn的分離純化和亞基組成

溪蟹卵巢勻漿液凝膠柱層析結(jié)果顯示成熟卵巢勻漿液主要含有1個(gè)蛋白質(zhì)峰, 洗脫時(shí)間在175—190min時(shí)該蛋白組分大量被洗脫出峰。由于甲殼動(dòng)物卵黃磷蛋白含有較多類(lèi)胡羅卜素, 連續(xù)光譜掃描的結(jié)果顯示卵黃磷蛋白在470 nm處有明顯的光吸收, 故該蛋白峰可能為溪蟹的Vn。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)該蛋白的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)(圖1), 該蛋白由3個(gè)亞基組成, 他們的分子量分別為102、84和70 kD。進(jìn)一步通過(guò)WesternBlotting實(shí)驗(yàn)表明, 該蛋白及3個(gè)蛋白亞基均可與溪蟹Vn的多克隆抗體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)(圖1)。

1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白; 2. 卵黃磷蛋白0.6 mg/mL; 3. 卵黃磷蛋白 0.8 mg/mL; 4. 卵黃磷蛋白Western-blotting

1. Molecular mass markers; 2. vitellin 0.6 mg/mL; 3. vitellin 0.8 mg/mL; 4. Vn Western-blotting

2.2 河南華溪蟹Vn抗體效價(jià)檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)化

由表1可見(jiàn)不同稀釋倍數(shù)的溪蟹Vn抗體對(duì)ELISA讀數(shù)的影響。抗體稀釋1000—200000倍時(shí),450讀數(shù)均顯著高于陰性對(duì)照且各濃度組差異顯著。同時(shí)抗體稀釋20萬(wàn)倍時(shí),450讀數(shù)與陰性對(duì)照呈顯著性差異, 這說(shuō)明該抗體具體較高的效價(jià)。由于抗體稀釋10萬(wàn)倍時(shí),450的差異系數(shù)僅為4.18%均低于各組, 因此本實(shí)驗(yàn)條件下的Vn抗血清最佳稀釋倍數(shù)為1︰100000。在上述優(yōu)化的Vn抗血清條件下, 將不同質(zhì)量濃度的Vn包被液按樣品直接包被法測(cè)定450值。

表1 河南華溪蟹Vn抗體不同稀釋倍數(shù)的ELISA反應(yīng)的A450值

注: 同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)含有不同上標(biāo)字母為差異顯著 (< 0.05);代表樣品量, 下同

Note: Values within a column having different superscript letter are significantly different (< 0.05);means sample number. The same applies bellow

表2結(jié)果顯示在Vn濃度在7.81—4000 ng/mL時(shí),450值差異顯著。由于Vn質(zhì)量濃度為7.81 ng/mL時(shí),450值與陰性對(duì)照相比不存在顯著差異。而當(dāng)Vn質(zhì)量濃度為15. 62 ng/mL時(shí),450值顯著高于7.81 ng/mL濃度組和陰性對(duì)照, 因此該方法檢測(cè)Vn可檢出值為15. 62 ng/mL左右。

表2 不同Vn質(zhì)量濃度的A450值

Vn質(zhì)量濃度在7.81—62.5 ng/mL時(shí),450的變異系數(shù)較大不符合標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求, 且在4000 ng/mL與2000 ng/mL Vn濃度組相比,450值不存在顯著差異, 因此選擇Vn質(zhì)量濃度為125、250、500、1000和2000 ng/mL制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2結(jié)果表明在該范圍內(nèi)Vn質(zhì)量濃度和450線性關(guān)系良好(= 0. 0008+ 0. 5565,2=0. 9763,< 0. 001,和分別代表Vn質(zhì)量濃度和450), 且各點(diǎn)的變異系數(shù)較低, 因此該標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)性和線性相關(guān)性均符合要求, Vn工作濃度范圍為125—2000 ng/mL。

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

根據(jù)建立的Vn-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線, 隨機(jī)取5只雌性溪蟹的卵巢組織進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)并重復(fù)3次。表3為驗(yàn)證性試驗(yàn)的結(jié)果, 批次間平均變異系數(shù)僅為7. 81%。批次間測(cè)定的Vn含量無(wú)顯著差異, 因此本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA測(cè)定方法具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

表3 河南華溪蟹卵巢中Vn的含量

2.4 鎘對(duì)河南華溪蟹卵巢中Vn含量的影響

圖3所示, 鎘染毒后, 各處理組卵巢中Vn含量與對(duì)照組比較有顯著性降低(< 0.05), 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng), 卵巢中Vn含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì), 并在鎘處理20d染毒組中達(dá)到最低值(31.42 ± 7.25) mg/g。

3 討論

在大多數(shù)的甲殼動(dòng)物中僅存在一種形式的卵黃磷蛋白[17, 18], 然而Serrano-Pinto等[19]和Laino等[20]的研究發(fā)現(xiàn)了兩種存在形式的卵黃磷蛋白。在本研究中, 通過(guò)凝膠過(guò)濾層析法純化了溪蟹成熟卵巢中的Vn。在經(jīng)過(guò)SDS處理后發(fā)現(xiàn)該蛋白分成3條多肽鏈, 分子量分別為102、84和70 kD, 并且各亞基彼此差異明顯, 這與其他甲殼動(dòng)物的研究結(jié)果存在一定的差異。大量研究表明甲殼動(dòng)物卵黃磷蛋白的分子量通常在200—700 kD, 且多由2—6個(gè)亞基組成, 如中華絨螯蟹()卵黃磷蛋白的分子量為520 kD, 兩種亞基的分子量分別為97和74 kD[13]; 銹斑()Vn兩個(gè)亞基分子量分別為105和76 kD[21]; 陸蟹() 3個(gè)亞基分子量分別為115、105和85 kD[22]; 日本沼蝦() 3個(gè)亞基分子量分別為110、96和89 kD[23]; 三疣梭子蟹卵黃磷蛋白的亞基數(shù)為三個(gè), 分子量分別為100、75和66 kD[14]; 克氏原螯蝦()Vn分子量為481 kD, 有六個(gè)亞基 (198、176、132、111、92、82 kD)[24]。

以分離純化后的溪蟹Vn為抗原, 制備了相應(yīng)的Vn抗血清。Western-blotting實(shí)驗(yàn)表明該抗血清可以特異地識(shí)別溪蟹中的Vn。這種較高的特異性確保該抗體可用于溪蟹體內(nèi)Vn的免疫學(xué)研究以建立一種Vn-ELISA法定量測(cè)定組織中的Vn的含量。當(dāng)前的研究表明本文建立的Vn-ELISA法具有較高的靈敏度, 最低可檢測(cè)到15.62 ng/mL的Vn, 其最佳的工作濃度范圍為125—2000 ng/mL。而在其他甲殼動(dòng)物中, 由Vn特異多抗血清建立的Vn-ELISA研究結(jié)果與本文的基本類(lèi)似。Volz等[25]在對(duì)橈足類(lèi)動(dòng)物的研究中建立Vn-ELISA工作范圍為31—1000 ng/mL, 精度為1.9 ng/mL。在中華絨螯蟹的研究中, Chen等建立了一個(gè)類(lèi)似的Vn-ELISA, 其測(cè)定范圍為8—500 ng/mL[13]。牡蠣()Vn-ELISA系統(tǒng)中的工作濃度為 10—400 ng/mL[26]。驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出本實(shí)驗(yàn)所建立的河南華溪蟹Vn-ELISA法在批次內(nèi)和批次間不存在顯著性差異, 同時(shí)具有較低的差異系數(shù), 因此該法具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。與當(dāng)前已經(jīng)發(fā)表的研究結(jié)果比較, 本實(shí)驗(yàn)所建立的Vn-ELISA工作范圍是可信和敏感的。該法所具有的較高的精確度使得可以在不同時(shí)間直接進(jìn)行樣本間卵黃磷蛋白含量的比較。為了使該法可以應(yīng)用與不同卵黃磷蛋白濃度的測(cè)定, 本文將純化好的卵黃磷蛋白稀釋為不同的濃度以建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線, 這樣可以定量測(cè)定在經(jīng)過(guò)鎘處理后溪蟹組織中的卵黃磷蛋白。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在經(jīng)過(guò)鎘的亞慢性染毒處理之后, 溪蟹卵巢中的Vn含量顯著降低, 這表明鎘暴露可抑制溪蟹中Vn的合成和積累。本實(shí)驗(yàn)室早期研究發(fā)現(xiàn)鎘處理后溪蟹卵巢指數(shù)顯著降低, 并認(rèn)為這可能是溪蟹體內(nèi)存儲(chǔ)的大量能量物質(zhì)被分解以用于能量合成的結(jié)果[27]。Vn作為溪蟹卵巢中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 它的減少則可能是導(dǎo)致卵巢發(fā)育異常的重要原因。Revathi等和Rodriguez等研究認(rèn)為鎘對(duì)Vn合成的抑制作用可導(dǎo)致卵巢中卵母細(xì)胞直徑減小, 這可延緩卵母細(xì)胞的成熟和卵子的發(fā)生, 進(jìn)而影響卵巢的正常發(fā)育和種群的繁殖[28, 29]。

在大部分的昆蟲(chóng)中, 卵黃磷蛋白在卵巢外先合成為卵黃磷蛋白的前體蛋白, 然后通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)輸送到卵巢, 然后被卵母細(xì)胞吸收。當(dāng)前關(guān)于甲殼動(dòng)物卵黃蛋白原的合成位點(diǎn)還沒(méi)有搞清楚, 一直都是研究的熱點(diǎn)。關(guān)于十足類(lèi)甲殼動(dòng)物Vg合成部位的研究結(jié)果顯示, 肝胰腺和卵巢是公認(rèn)的主要的合成部位, 其次是血細(xì)胞和皮下脂肪體, 因此在甲殼動(dòng)物中Vg的合成可能是內(nèi)源的或外源的或兩者兼有。在一些種類(lèi)中, Vg在卵巢中合成, 如短溝對(duì)蝦()[30]。而在另一些甲殼動(dòng)物種類(lèi)中, Vg在肝胰腺中合成, 如一種溪蟹()[31]。對(duì)于不同種甲殼動(dòng)物, Vg合成部位的研究結(jié)果不盡相同。當(dāng)前關(guān)于河南華溪蟹卵黃磷蛋白的研究較少, 因此, 可以在本文研究的基礎(chǔ)上, 進(jìn)一步探討河南華溪蟹卵黃發(fā)生部位和鎘對(duì)Vn合成影響的機(jī)理。

致謝:感謝鄒恩民教授對(duì)論文的修改給予的指導(dǎo)幫助。

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ESTABLISHED OF ELISA METHOD OF VITELLIN FROM FRESHWATER CRAB () AND EFFECT OF CADMIUM ON VITELLIN ACCUMULATION IN OVARY

Yang Jian1, Liu Dong-mei2, He Yong-ji1, Hans-Uwe Dahms3and Wang Lan1

(1. School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. School of Basic Medical,Shanxi Medical University, Taiyuan 030006, China; 3. School of Life Science, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung 80708,Taiwan, China)

To explore the effect of cadmium (Cd) on oogenesis of freshwater crab (), vitellin (Vn) and the method of Vn-ELISA was studied and established. Vn was purified from mature ovaries ofby gel filtration chromatography. Using SDS- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), the molecular weight and the quantity of Vn subunit were determined. Based on the purified Vn and Vn anti-serum, the reaction parameters for an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed. To explore the effect of cadmium on the Vn in the ovaries, freshwater crab.weretreated with 5.8 mg/L Cd for 10, 15, and 20d. The results showed that Vn was composed of three subunits (116, 66 and 45 kD). Western-blotting confirmed the polypeptides had a specific reactivity with mouse polyclonal Vn anti-serum. The optimal dilution rates of Vn anti-serum were shown to be 1︰100000. According to these optimal parameters, the standard linear equation was established for the determination of Vn concentration with a valid range of 125—2000 ng/mL, and qualitative detection can be 15.62 ng/mL. In verification experiments, Vn content in the ovaries showed no significant differences, and the mean coefficients of variation of inter-assay were 7.81%, suggesting that the developed ELISA of this study was precise, stable and repeatable. Moreover, Cd caused a time-dependend down-regulation of Vn level, and showed significant effects of Cd on vitellogenesis, which suggest that Cd slows down oocyte maturation and vitellogenesis in

; Vitellin; SDS-polyacrylamide gel electrophoresis; Enzyme-linked immunosorbent assay; Cadmium

10.7541/2015.38

X174

A

1000-3207(2015)02-0287-07

2014-09-04;

2014-12-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 30870267, No. 30970361); 山西省回國(guó)留學(xué)人員科研項(xiàng)目(No. 2010015); 山西省普通高校特色重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(No. 2011-SXDX-SWX-003)資助

楊健(1988—), 男, 山西長(zhǎng)治人; 博士; 主要從事環(huán)境重金屬污染研究方向。E-mail: yangjian333001@126.com

王蘭(1960—), 女, 山西太原人; 教授; 主要從事典型重金屬污染的細(xì)胞與分子機(jī)制研究方向。E-mail: lanwang@sxu.edu.cn