黃魁英 ，肖安吉，盧志鵬，楚品品，杜少平，明飛平，夏楓耿，黃朝遠(yuǎn)，楊軍，蔡海明，馬苗鵬，張玲華

1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.廣州市微生物研究所，廣東 廣州 510663

人體消化道內(nèi)存在的微生物總數(shù)達1014個[1]，菌體總重量1000～1500 g，占人體總重的1/70～1/50[2]。雙歧桿菌在成人腸道中占腸道總菌數(shù)的3%～10%，在嬰兒腸道占到91%以上[3]。隨著年齡的增長，體內(nèi)有效的有活性的乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量會逐漸下降，為了保持腸道菌數(shù)，需要進食能提高相關(guān)益生菌活性的食物，最常見的添加益生菌是乳桿菌和雙歧桿菌2個屬[4-5]。益生菌具有如下特點：活性強，在體內(nèi)不易被殺死；數(shù)量多，只有大量攝入并且大量存活在體內(nèi)才能發(fā)揮功效；對正常的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，使有益菌繁殖從而抑制有害菌的生長；產(chǎn)生其他一些促進健康的作用，如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、降膽固醇等[6]。研究表明，維持益生菌功能的最低活菌濃度應(yīng)高于107CFU/mL[7]。

目前我國益生菌產(chǎn)品面臨的關(guān)鍵問題是工業(yè)、胃腸道脅迫對菌株的各種破壞效應(yīng)，如產(chǎn)品的制造、貯存、銷售、食用過程。雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等益生菌多為厭氧菌或兼性厭氧菌，生長過程中不形成芽孢，抗性較差，生命活動中還會產(chǎn)生一些危及自身繁殖的乳酸和乙酸等代謝物，故在液體條件下難以長期保存；另外，益生菌產(chǎn)品的貯存和運輸均要求冷鏈，貨架期較短[8]。

為了尋找活性較好的益生菌，并探究在常溫下保持其較高活性的可行方法，我們采用均勻?qū)嶒炘O(shè)計方案，摸索分離自嬰兒糞便的嗜酸乳桿菌和長雙歧桿菌的保護劑成分最佳比例，為這類益生菌在日常生活中實現(xiàn)簡單的常溫保存、利于實際生產(chǎn)過程中的運輸和保存提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

乳酸菌原培養(yǎng)基（500 mL）：蛋白胨5 g，酵母膏2.5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，醋酸鈉2 g，瓊脂7.5 g，水500 mL。121℃高溫濕熱滅菌22 min。

雙歧桿菌原培養(yǎng)基（500 mL）：蛋白胨5 g，酵母膏10 g，葡萄糖10 g，西紅柿汁166 mL，吐溫80 1 mL，瓊脂7.5 g，水333 mL。121℃高溫濕熱滅菌22 min。

1.2 獲取菌源及乳酸菌和雙歧桿菌的分離

收取嬰兒糞便約0.1 g，置于盛有10 mL無菌水的試管中，充分搖勻后吸取1 mL 稀釋液加至9 mL無菌水中，重復(fù)相同操作便可得到1/10 梯度稀釋的糞便稀釋液。選擇1/103、1/104、1/105梯度的稀釋液，用涂布法培養(yǎng)于乳酸菌篩選培養(yǎng)基中，用滾管法培養(yǎng)于雙歧桿菌篩選培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，最后鑒別并挑選乳酸菌和雙歧桿菌的單菌落，并編號。

1.3 菌株的純化即優(yōu)良菌種篩選

在無菌條件下，用接種環(huán)挑取鑒定培養(yǎng)基上初步確定的革蘭陽性菌落，在MRS平板培養(yǎng)基上劃線分離，37℃倒置厭氧培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落進行鏡檢，直至確定所得菌株已經(jīng)純化。然后接種到液體培養(yǎng)基中保存，其中一部分菌液用甘油于4℃保存，作為菌種。

對各菌種進行耐溫、耐鹽和產(chǎn)酸檢測，挑出綜合性能較好的菌種。

1.4 探索菌株保存條件

將嗜酸乳桿菌的保護劑成分[9]和長雙歧桿菌的保護劑成分[10]按照均勻設(shè)計方法調(diào)配（表1、2）。

1.5 添加菌種保存

用磷酸緩沖液將表1、2中不同濃度的保護劑配制成不同配方的復(fù)合保護劑10 mL，分別取500 μL復(fù)合保護劑加入450 μL 菌液和50 μL 甘油的混合液，預(yù)先放在4℃中保存10 min，待菌液充分低溫，用離心干燥機干燥，每隔10 min稱重，干燥到2次稱量質(zhì)量差少于0.01 g時即干燥完成。

1.6 37℃加速常溫存放

將干燥后的菌種于37℃恒溫箱中存放，1 d 相當(dāng)于常溫下4 d（加速4倍時間）。

1.7 檢測保存后菌種活性

每10 d取出樣品進行活菌數(shù)檢測，對收集的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)處理，調(diào)配出最佳配方。

1.8 重新保存

用最佳配方重復(fù)保存菌種，記錄數(shù)據(jù)，觀察保存效果。

表2 長雙歧桿菌的保護劑配方（g/L）

2 結(jié)果

2.1 菌種的分離鑒定

分離獲得一株革蘭陽性菌，形態(tài)呈細(xì)長桿狀，最適生長溫度為35～38℃，20℃以下不生長，耐熱性差；最適pH 值為5.5～6.0，耐酸性強，能在其他乳酸菌不能生長的環(huán)境中生長繁殖；能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進行同型發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)生DL型乳酸；蛋白質(zhì)分解力弱。最終確定該菌種為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus），命名為10A31。屬乳桿菌科的乳桿菌屬細(xì)菌廣泛存在于人及一些動物的腸道中，是有益微生物菌群，對維持胃腸道的生理功能有重要作用。

分離到的另一株菌為嚴(yán)格厭氧型革蘭陽性菌，細(xì)胞通常為分叉形狀，最適生長溫度為37～41℃，起始生長pH 值為6.7～7.0，pH 值低于4.5 和高于8.5 時不生長；卵磷脂酶反應(yīng)、過氧化氫酶反應(yīng)、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、聯(lián)苯胺反應(yīng)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗均呈陰性；不分解鼠李糖、甘油、纖維二糖、甘露醇、淀粉，能分解阿拉伯糖、木糖、核糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖、半乳糖，對山梨糖分解遲緩；代謝產(chǎn)物產(chǎn)生乙酸和乳酸，不產(chǎn)生甲酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸。最終確定該菌種為長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum），命名為11A11。

經(jīng)培養(yǎng)，嗜酸乳桿菌10A31 菌落數(shù)能達到的最大數(shù)量為2.40×1010CFU/mL，長雙歧桿菌11A11菌落數(shù)能達到的最大數(shù)量為7.20×109CFU/mL。經(jīng)過篩選的菌種除了具有比較高的活性外，還有較高的耐溫、耐鹽、產(chǎn)酸性質(zhì)。

2.2 嗜酸乳桿菌10A31的保存配方優(yōu)化

實際菌落數(shù)按下式計算：

按照上述公式的計算結(jié)果見表3。可以看出，添加了保護劑，的確可以增強嗜酸乳桿菌10A31 在常溫下的保存效果。為了避免正交試驗所需大量試驗次數(shù)，我們采用簡單方便的均勻設(shè)計實驗。3 因素8 水平，用均勻設(shè)計實驗需要做8 次平行，而用正交試驗卻需要做84次平行。在前4 次計數(shù)中，干燥后的菌落數(shù)都穩(wěn)定地保持在109CFU/g水平。

用軟件Excel分析表3數(shù)據(jù)，由卡方分析可知麥芽糖對嗜酸乳桿菌10A31 的保存存在不相關(guān)關(guān)系，因此可忽略保護劑配方中麥芽糖這一因素。由回歸分析可得：

其中，y為每克嗜酸乳桿菌10A31中含有的細(xì)菌菌落總數(shù)（CFU/g），x1為海藻糖的濃度（g/L），x2為谷氨酸的濃度（g/L），x3為天冬氨酸的濃度（g/L）。

計算得出嗜酸乳桿菌10A31保護劑最佳配方及濃度為：海藻糖0.05 g/L，谷氨酸0.24 g/L，天冬氨酸0.24 g/L。即，保護劑最佳配方比例為海藻糖∶谷氨酸∶天冬氨酸=5∶24∶24。

2.3 長雙歧桿菌11A11的保存配方優(yōu)化

同樣根據(jù)上述公式計算，結(jié)果見表4。干燥后的菌落數(shù)在第3 次計數(shù)時僅為108CFU/g，且活性不穩(wěn)定。在第40 d計數(shù)時，活菌數(shù)達不到106CFU/g。

用軟件Excel分析表4，由回歸分析可得：

其中，y為每克長雙歧桿菌11A11中含有的細(xì)菌菌落總數(shù)（CFU/g），x1為海藻糖的濃度（g/L），x2為谷氨酸的濃度（g/L），x3為麥芽糖的濃度（g/L）。

同樣按照嗜酸乳桿菌數(shù)據(jù)處理方法，得出長雙歧桿菌11A11 的保護劑最佳配方及濃度為：海藻糖0.34 g/L，谷氨酸0.11 g/L，麥芽糖0.24 g/L。即，保護劑最佳配方比例為海藻糖∶谷氨酸∶麥芽糖=34∶11∶10。

2.4 最佳配方保存試驗

采用嗜酸乳桿菌10A31 保護劑最佳配方（海藻糖0.05 g/L，谷氨酸0.24 g/L，天冬氨酸0.24 g/L）重新用于菌株保存，在第5 次實驗（相當(dāng)于常溫下的200 d）時，最終菌落數(shù)為3.87×109CFU/g。

采用長雙歧桿菌11A11 保護劑最佳配方（海藻糖0.34 g/L，谷氨酸0.11 g/L，麥芽糖0.24 g/L）重新用于菌株保存，第4次實驗（相當(dāng)于常溫下的160 d）時菌落數(shù)為1.53×109CFU/g，而第5 次實驗時為6.80×107CFU/g。與之前實驗數(shù)據(jù)比較，可以看出優(yōu)化后最佳配方的活菌數(shù)明顯比優(yōu)化前有所提高。

表3 嗜酸乳桿菌10A31的菌落數(shù)（CFU/g）

表4 長雙歧桿菌11A11的菌落數(shù)（CFU/g）

由圖1 可知，嗜酸乳桿菌10A31 在最佳配方保護劑條件下，200 d時仍然可以保持較高的菌活性，菌落數(shù)水平在109CFU/g 以上；長雙歧桿菌11A11在160 d時菌落數(shù)水平可達109CFU/g，但在200 d時菌落數(shù)急劇下降。2種益生菌的菌落數(shù)都隨著時間的延長而逐漸減少，菌活性也隨之降低。嗜酸乳桿菌由于厭氧要求比長雙歧桿菌低，因此保存難度相對簡單。在最佳保護劑保存下，這2 類益生菌能在160～200 d內(nèi)保持較高的活菌水平。

圖1 益生菌采用最佳保護劑配方的常溫保存菌落計數(shù)

3 討論

從實驗結(jié)果可以看出，2 種保護劑成分都是具有一定黏性的物質(zhì)，能在菌表面形成一定的覆蓋膜，使菌體遠(yuǎn)離空氣中氧氣的毒害作用。其中，海藻糖的比例都比較高，可見海藻糖對于菌種保存具有不可忽視的作用。

本實驗所得保護劑能把益生菌在較長時間（嗜酸乳桿菌200 d，長雙歧桿菌160 d）內(nèi)保護在109CFU/g 水平。通過均勻設(shè)計實驗方法探究保護劑的成分最佳配方，相比于正交試驗，大大縮減了實驗次數(shù)和復(fù)雜程度，且簡單有效。后續(xù)擬針對不通過37℃加速培養(yǎng)，延長菌株活性檢測時間，擴大保護劑的成分進行探索，以完善常溫保存益生菌的最佳保護劑配方。

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