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雙信號放大的酶聯(lián)免疫吸附測定新方法研究及應用

2015-11-29 08:32:08張愛紅林虹君任勇濤
生物技術通訊 2015年6期
關鍵詞:透射電鏡功能化石墨

張愛紅,林虹君,任勇濤

1.防化學院,北京 102205;2.空軍防化大隊,北京 102206

1971 年瑞典學者Engvall 和Perlmann[1]、荷蘭學者van Weerman 和Schuurs[2]分別報道了將免疫技術發(fā)展成為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法,即酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。ELISA 是在免疫酶技術基礎上發(fā)展起來的新型免疫測定技術,通過多年來的不斷改進,現(xiàn)已成為一種有效的生化分析方法,并廣泛應用于醫(yī)學、生物學等領域[3]。但隨著研究的不斷深入,人們對痕量,甚至超痕量樣本的測定越來越多,這對ELISA 的檢測限提出了新的、更高的要求。另外,ELISA 的影響因素較多,容易造成結果失真,時間和操作要求非常嚴格,對于陽性的區(qū)別比較模糊,有時候需要反復實驗等。這些因素的存在都大大限制了其應用。

鑒于目前存在的局限性,我們在傳統(tǒng)ELISA 方法中引入了納米金粒子(Au nanoparticles,AuNPs)和氧化石墨烯(graphene oxide,GO)。由于這兩種材料都具有制備過程簡單、比表面積大、易與蛋白質結合、能保持抗體生物活性等優(yōu)點,在生物學領域得到了廣泛應用[4-5]。本研究旨在通過抗體功能化的AuNPs 和GO 的引入,逐級放大檢測信號,以減低ELISA的檢測限,擴大該方法的適用范圍和領域。

1 材料與方法

1.1 材料

谷胱甘肽S 轉移酶(GST)、GST-Ab1、HRP-Ab2(購自北京康為試劑公司);聚二甲基氯化銨(PDDA,20%,Mr:200 000~350 000)、牛血清白蛋白(BSA)、1-乙基-3-(3-二甲基氨)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(購自Sigma-Aldrich 公司);石墨(美國Alfa Aesar公司);氯金酸(HAuCl4·4H2O,南京市威圣化工貿(mào)易有限公司);檸檬酸鈉(上海創(chuàng)順化工有限公司);KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20(購自北京化學試劑公司);實驗用水為二次蒸餾水。

Milli-Q 型密理博純水儀(≥18 MΩ,美國Millipore公司);Tecnai G2 20型透射電鏡(FEI香港有限公司);PHI 5000C ESCA 型X 線光電子能譜儀(美國RBD公司);85-2數(shù)顯型恒溫攪拌器(國瑞試驗儀器廠);SORVSLL 型LEGEND MICRO 17 centrifrige(Therno 公司);Dimension V 型原子力顯微鏡(美國Veeco公司)。

1.2 AuNPs與AuNPs-GST-Ab1的制備

將1 mL 濃度為10 g/L 的氯金酸溶液加入100 mL雙蒸水中,加熱至沸騰,然后迅速加入2.5 mL濃度10 g/L 的檸檬酸鈉溶液,充分攪拌,保持沸騰15 min。這期間溶液顏色依次由灰變藍再變紫,最后為酒紅色。移去熱源,自然冷卻至室溫,即制得平均粒徑為16 nm 的金顆粒,4℃保存?zhèn)溆肹6]。納米金在制備過程中,要保證所用玻璃器皿的絕對清潔,首先將所用器皿用王水(濃HNO3∶濃HCl=1∶3)浸泡過夜,然后用雙蒸水沖洗3 次,烘干待用。在加入檸檬酸鈉后要充分攪拌,以免形成的納米金顆粒聚集。在納米金與抗體結合后,要用錫箔包裹避光保存,以避免該結合體見光解離,最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

在制備AuNPs 的基礎上,將0.3 mg GST-Ab1加入pH6.0 的納米金溶液中,室溫下攪拌2 h;然后加入2 mL 濃度為10 g/L 的BSA 溶液,室溫封閉30 min;13 300 r/min 離心10 min,溶液分成上、下兩層,上層為沒有結合的抗體,下層為黑色、松軟的結合物;除去上清,用含10 g/L BSA 的PBS 緩沖液(pH7.2~7.4)將產(chǎn)物(AuNPs-GST-Ab1)洗滌并離心3 次,最后溶于PBS 中,置于4℃?zhèn)溆?,該產(chǎn)物能在一個月內保持活性[7]。

1.3 GO和GO-Ab2的制備

圖1 AuNPs(A)和AuNPs-GST-Ab1(B)的透射電鏡圖

石墨烯,又稱單層石墨或二維石墨,是單原子厚度的二維碳原子晶體,被認為是富勒烯、碳納米管和石墨的基本結構單元。石墨烯因具有大的比表面積、突出的導熱性能和力學性能及非凡的電子傳遞性能等一系列優(yōu)異性質,被業(yè)內人士廣泛關注[8-11]。制備GO 的方法很多,而將石墨氧化成氧化石墨,再在超聲條件下得到單層的GO溶液,已成為GO制備的有效途徑[12]。具體步驟如下:首先將0.5 g石墨粉末和0.5 g硝酸鈉加入23 mL預冷的濃硫酸中,攪拌反應10 min;然后緩慢加入4 g高錳酸鉀,35℃反應1 h;再向反應體系中緩慢加入40 mL 蒸餾水,95℃反應1 h,加入100 mL 蒸餾水終止反應;然后加入2 mL 濃度為30%的H2O2,室溫反應2 h,將產(chǎn)物離心,并用1 L的HCl(5%)洗滌,隨后用4 L蒸餾水洗滌,離心并再次洗滌;將得到的產(chǎn)物于40℃真空干燥48 h,即為GO粉末,置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

將50 mg NaOH 和ClCH2COONa 加入1 mL 濃度為1 mg/mL的GO溶液中,超聲波裂解1.5 h;將產(chǎn)物GO-COOH 用雙蒸水洗滌3 次,除去過量的堿;將400 mmol/L EDC 和200 mmol/L NHS 一起加入1 mL MES緩沖液(pH6.0)中反應30 min;將混合物于13 300 r/min 離心5 min,除去上清,此過程重復3次;將得到的GO-Ab2 溶于含有10 g/L BSA 的1.0 mL PBS(pH7.4)中,置于4℃?zhèn)溆肹8]。

2 結果和討論

2.1 AuNPs與AuNPs-GST-Ab1的表征

圖1A為AuNPs 的透射電鏡圖,圖1B為AuNPs-GST-Ab1 的透射電鏡圖??梢钥闯觯珹uNPs 為黑色球狀物,粒徑為16 nm。AuNPs 與GST 的抗體結合后,形成包裹黑色AuNPs顆粒的絮狀物。

2.2 GO與GO-Ab2的表征

圖2A 為GO 的透射電鏡圖,圖2B 為GO-Ab2 的透射電鏡圖,上面的黑色斑點為結合在GO片上的抗體。為保證GO與二抗的結合率,又不破壞抗體的活性,在由石墨制備得到GO 后,要用去離子水透析GO-COOH懸浮液48 h以上,以除去所有離子,因為雜質粒子的存在對GO 與抗體的結合會產(chǎn)生非常不利的影響;然后將GO、EDC、NHS 和MES 緩沖液混合,反應30 min,此時加入的EDC要過量,因為EDC遇水迅速發(fā)生水解,量太少不能發(fā)揮縮合的作用。

圖2 GO(A)和GO-Ab2(B)的透射電鏡圖

2.3 ELISA應用

將抗體功能化的納米金和GO 用于ELISA 試驗。首先將GST附著在固相載體上,形成固相抗原,洗滌除去未結合的蛋白質及雜質;然后加GST-Ab1與37℃撫育2 h,使抗體和GST結合形成抗原-抗體復合物;洗滌除去未結合物質;加入酶標抗體(HRPAb2),37℃撫育1 h,使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合;洗滌未結合的酶標抗體;此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關;最后加底物顯色,固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物;通過酶標儀讀數(shù),測知GST 的量。ELISA 方法的操作流程如圖3所示。

圖3 改進的ELISA(B)與傳統(tǒng)方法(A)對比示意圖

在A 路線中,每一個GST 分子只能結合一個對應的一抗,而每個一抗也只能結合一個二抗和HRP;而在改進后的B 路線中,每個GST 分子與結合在納米金顆粒上的多個(假定為x個,則x>1)一抗中的一個結合,而其余一抗又可以和GO 上的二抗結合,通過GO 的連接作用,每個二抗可以和多個(假定為y個,y>1)HRP 形成結合體,通過納米金和GO 的2 次串聯(lián)放大作用,能夠將較小的GST信號逐級放大,提高了檢測的靈敏度。

圖4 改進后(A)與改進前(C)ELISA結果對比圖B、D為陽性對照

為了考察改進后ELISA 方法的性能,用抗體功能化的納米金顆粒和GO 對GST 進行檢測。在圖4中,A 和C 行對應的GST 濃度和稀釋方法(依次1/3梯度稀釋)完全相同,其中A 行使用AuNPs-Ab1 和GO-Ab2-HRPs,C 行使用傳統(tǒng)的Ab1 和Ab2-HRP,其余實驗因素完全相同。結果表明,對抗體功能化修飾后,ELISA 的檢測限從1.62 μg/mL 降低至0.02 μg/mL,檢測能力擴大了81 倍。所以,用納米金和GO功能化修飾后的抗體分別代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗體,可以有效地降低檢測限。多次試驗結果表明該方法穩(wěn)定,重復性好,可對樣本中低濃度蛋白質進行靈敏檢測。

綜上,通過AuNPs 和GO 對抗體進行功能化修飾,用于ELISA檢測的雙信號放大,提高了該方法的檢測靈敏度,降低了檢測限,提高了其對痕量樣本的檢測能力,擴大了應用范圍。而且該方法重復性好,操作簡便,具有很強的實用價值??梢灶A見,改進后的方法將會在蛋白質檢測和診斷學研究中發(fā)揮應有的作用。

[1]Engvall E,Perlmann P.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)Quantitative assay of immunoglobulin G[J].Immunochemistry,1971,8:871-874.

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