張紅梅，蔣 葉，李大千，夏文穎，陳 丹，荊俊鵬，王 悅，楊大恒，徐 建，潘世揚

0 引 言

循環(huán)DNA主要存在于人血漿和血清等體液中，大量研究表明，血漿DNA水平與腫瘤負荷相關(guān)，與腫瘤的診斷、治療療效、病程監(jiān)測及預后密切相關(guān)［1-6］，但在血液系統(tǒng)腫瘤中的研究報道相對較少。慢性白血病是一組異質(zhì)性造血系統(tǒng)腫瘤，慢性白血病細胞具有一定的分化成熟能力，多為較成熟的幼稚細胞和成熟細胞，其病情發(fā)展慢，自然病程可為數(shù)年，其中常見的是慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)和毛細胞白血病(hairy cell leukemia，HCL)。目前慢性白血病的診斷、療效判斷及病程監(jiān)測在臨床上多依賴骨髓組織細胞學檢查。有研究報道，白血病患者外周血中循環(huán)DNA的異常增高早于骨髓檢查，認為血漿循環(huán)DNA可代替骨髓細胞用于白血病的輔助診斷［7］。因此，本研究以慢性白血病患者為研究對象，初步探討探討血漿循環(huán)DNA定量檢測在慢性白血病療效評估中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2008年5月至2014年8月南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和南京市江寧醫(yī)院血液科住院患者CML52例、CLL85例和HCL患者4例。男性99例，女性42例。CML患者中位年齡48歲，其中慢性期33例、急變期12例、加速期7例，經(jīng)酪氨酸酶抑制劑TKI聯(lián)合化療后部分患者達完全血液學緩解或細胞遺傳學緩解;CLL患者中位年齡61歲，在FC方案或FCR等方案化療后，經(jīng)CLL療效標準判斷［8］，28例患者達到完全緩解(complete remission，CR)，27例部分緩解(partial remission，PR)，30例未緩解(non-remission，NR)，分別為 CR組、PR組、NR組;HCL中位年齡62歲。選擇南京市江寧醫(yī)院80例體檢健康者作為對照組，男性43例，女性37例，中位年齡45歲。

1.2 試劑與儀器 磁珠法提取DNA試劑盒(上海浩源公司)，PCR擴增試劑(TaKaRa公司)。目的基因βactin和標準內(nèi)參照物重組質(zhì)粒DNA的引物及TaqMan探針由Invitrogen公司合成，序列參見文獻［9］。7500型熒光定量基因擴增儀(Applied Biosystems公司)。

1.3 標本處理 采集靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，于室溫1 600×g離心10min，小心轉(zhuǎn)移上層血漿，再于4℃、16 000×g離心10 min，上層無細胞血漿每管200 μL分裝于加入人工重組質(zhì)粒樣品保存管中，渦旋混勻后置-70℃待測。

1.4 血漿DNA定量檢測 用磁珠法對血漿DNA和重組質(zhì)粒DNA同步提取，再對人β-actin基因和內(nèi)參照質(zhì)粒DNA進行雙重熒光定量PCR，具體操作及計算參照文獻［9-10］。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用Stata/SE 9.2統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。血漿DNA定量結(jié)果資料呈非正態(tài)分布，以中位數(shù)［M(P25，P75)］表示，成組設計組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，兩兩比較采用Whitney秩和檢驗;化療前后比較采用Wilcoxon配對秩和檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢性白血病患者診斷時血漿DNA含量的測定診斷時，CML和CLL患者血漿DNA含量均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。而HCL患者血漿DNA含量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.200)，CML、CLL 和 HCL 患者之間血漿 DNA含量差異亦無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 CML患者不同階段血漿DNA含量測定 CML慢性期患者血漿DNA含量顯著高于急變期患者和加速期患者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。但加速期患者和急變期患者血漿DNA含量差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見表1。

2.3 CML患者在化療前后DNA含量測定 CML患者化療后血漿DNA含量顯著低于化療前血漿DNA含量，且顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。見表1。

2.4 CLL患者不同化療療效組血漿DNA含量測定CLL患者CR組血漿DNA含量顯著低于PR組和NR組，差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0.001);與對照組血漿DNA含量比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.125)。PR組、NR組血漿DNA含量顯著高于對照組 (P＜0.001)。見表1。

表1 慢性白血病患者不同時期血漿DNA含量的結(jié)果［M(p25，p75)，ng/mL)］Table 1 The level of plasma DNA in patients with chronic leukemia ［(M(p25，p75)，ng/mL］

3 討 論

慢性白血病起病緩慢，病程長，早期多無明顯癥狀，患者多在體格檢查或其他疾病就診時發(fā)現(xiàn)。95%的慢性白血病為CML，CML以慢性期起病，發(fā)病年齡在20～60歲，臨床病程可分為慢性期、加速期及急變期。CLL主要見于老年人，病程進展緩慢，中位生存期＞10年。HCL較為少見，白血病細胞胞質(zhì)形成細長的突起，形似絨毛，平均發(fā)病年齡50歲，預后多不良。目前，臨床使用的最直接的判斷慢性白血病化療療效的檢測手段為骨髓穿刺和活檢，但骨髓穿刺為有創(chuàng)檢測。相關(guān)文獻表明，循環(huán)血漿DNA可以作為早期監(jiān)測腫瘤的分子生物標記［11-13］，并且可以評判腫瘤化療療效［14］。

循環(huán)DNA為主要存在于血液、滑膜液、腦脊液等體液中的細胞外DNA。Leon等［15］首先發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血漿DNA水平明顯增高，且與患者的預后及療效有關(guān);Stroun等［16］首先對腫瘤患者體內(nèi)的游離循環(huán)DNA的序列進行了檢測，在腫瘤患者體內(nèi)的游離循環(huán) DNA 上相繼檢測到了 K-ras、N-ras、P53、APC等基因的突變［2，4，17-19］。同時發(fā)現(xiàn)癌癥患者在接受化療后，其體內(nèi)游離循環(huán) DNA的濃度會降低到90%［20］，而正常人體內(nèi)的游離循環(huán)DNA的水平就相對穩(wěn)定。隨后在肺癌、乳腺癌、消化道腫瘤等多種實體腫瘤中發(fā)現(xiàn)血漿DNA具有腫瘤相關(guān)的特征性改變［21-23］，提示循環(huán)DNA有望成為新的腫瘤分子標志物。

本研究結(jié)果顯示，診斷時由于大量白血病細胞的存在，CML和CLL患者血漿DNA含量均明顯高于對照組;HCL患者血漿DNA含量亦高于對照組但無差異，這可能是樣本數(shù)偏少所致。由此推斷慢性白血病患者體內(nèi)大量腫瘤細胞釋放DNA導致血漿DNA水平升高，Stroun等［23］證實游離循環(huán)DNA先是在細胞內(nèi)復制合成，然后釋放出細胞，新合成的DNA被優(yōu)先釋放。在CML患者中，慢性期患者血漿DNA含量明顯高于急變期和加速期患者。原因是CML慢性期白細胞計數(shù)顯著增高，釋放大量DNA，而進入加速期和急變期后，由于降白細胞治療，白細胞數(shù)量相比慢性期顯著降低;其血漿DNA水平亦相應降低。

本研究前期已證實，血漿DNA定量檢測在AML和ALL的的化療療效評估中均具有重要意義［24-25］。本研究對 CML患者進行化療后血漿DNA的定量檢測，其血漿DNA水平顯著低于化療前但顯著高于對照組，結(jié)果表明CML患者在接受化療后病情得到有效控制，但因為疾病進展緩慢，故而病情恢復亦緩慢。對CLL患者化療后不同療效組血漿DNA水平研究結(jié)果顯示，CR組與對照組之間無差異，提示患者化療效果良好，病情得到有效控制。PR組血漿DNA水平顯著高于對照組及CR組，但顯著低于NR組，結(jié)果提示患者化療后病情有所控制，但治療效果并不理想;或者患者化療前病情嚴重于CR組患者;抑或患者因個體差異導致治療效果差異。NR組患者化療后血漿DNA水平顯著高于對照組、CR組及PR組，結(jié)果提示該組患者化療效果無效或者治療效果不好，需要進一步化療或者更改化療方案。

本研究結(jié)果表明，血漿DNA的定量檢測在慢性白血病的化療療效評價中具有重要的臨床意義。盡管CML已經(jīng)有非常好的分子生物學療效評估指標BCR/ABL，但是BCR/ABL檢測需要通過骨髓穿刺獲得患者的骨髓標本，此項檢測為有創(chuàng)檢測。血漿循環(huán)DNA檢測僅需要患者血液，為無創(chuàng)檢測。血漿DNA定量檢測具有取樣方便、無創(chuàng)、敏感性高、重復性好等優(yōu)勢，可減少患者反復骨髓穿刺的創(chuàng)傷，方便臨床醫(yī)師對隨訪患者的病情進展及療效進行監(jiān)測［26］。

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