王一鳴，程燕，樹瑜

(成都市第二人民醫(yī)院，成都610017)

尖銳濕疣(CA)系人乳頭瘤病毒(HPV)感染所致的一種常見和易復(fù)發(fā)的性傳播疾病，其發(fā)生、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)歸可能與HPV載量及機(jī)體的免疫狀況有關(guān)。細(xì)胞免疫功能異?？赡苁窃斐刹《境掷m(xù)感染的主要原因之一，尤其是T淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的異常。本文對(duì)CA患者病毒載量及外周血T淋巴細(xì)胞亞群(CD+3、CD+4、CD+8)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)細(xì)胞免疫與病毒載量之間相互關(guān)系進(jìn)行了分析，旨在為CA發(fā)病機(jī)制及其治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1～12月本院皮膚性病科門診就診的CA患者81例(CA組)，均符合衛(wèi)生部疾病控制司制定的CA診斷標(biāo)準(zhǔn)。男49例、女32例，年齡20～70歲。初發(fā)患者41例，復(fù)發(fā)患者40例。30例正常對(duì)照來(lái)自本院包皮環(huán)切術(shù)的健康男性(對(duì)照組)，近期無(wú)局部感染和CA史。排除免疫功能低下或長(zhǎng)期服用免疫抑制劑、糖尿病、不能定期隨訪者。

1.2 CA患者外周血CD+3、CD+4、CD+8T細(xì)胞百分比的檢測(cè) 治療前后1個(gè)月取外周血2 mL，加入到EDTA抗凝管中，混勻。取流式細(xì)胞儀上樣管，每管中加入外周血100 μL(經(jīng)EDTA抗凝處理)混勻，然后分別加入 20 μL CD3-FITC、CD4-FITC/CD8-PE 抗體，充分混勻，室溫避光孵育30 min，隔10 min手工輕搖1次，以便熒光標(biāo)記抗體與樣品充分反應(yīng)，然后加入紅細(xì)胞裂解液500 μL充分混勻，避光孵育10 min，PBS 洗細(xì)胞 1 次(2 000 r/min，5 min)，棄去上清液，每管加500 μL鞘液，充分混勻，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 CA組織中HPV6/11 DNA水平的檢測(cè) 采用PCR法。暴露疣體，常規(guī)消毒，用血管鉗摘取部分疣體組織，部分標(biāo)本置入備有1 mL生理鹽水的無(wú)菌樣本管中，標(biāo)本存于-20℃冰箱待檢。部分標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛室溫固定、石蠟包埋、室溫存放、實(shí)驗(yàn)時(shí)將標(biāo)本制成4 μm厚的石蠟切片。DNA提取:取出待測(cè)樣本(組織需剪碎)，置于室溫下解凍，振蕩混勻后取100 μL于另一無(wú)菌的0.5 mL離心管內(nèi)，13 000 r/min離心10 min，小心吸棄上清液，保留沉淀物，再向沉淀物內(nèi)加入DNA提取液50 μL，振蕩混勻，100℃沸水浴10 min，13 000 r/min離心10 min，保留上清液待用。DNA抽提和PCR擴(kuò)增:HPV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和標(biāo)本處理按試劑盒說(shuō)明書操作。取PCR反應(yīng)管1支，加入處理后的標(biāo)本或陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品2 μL，8 000 r/min離心數(shù)秒，將各反應(yīng)管放入PCR儀的反應(yīng)槽內(nèi)，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品梯度及未知標(biāo)本采用熱啟動(dòng)法擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:93℃預(yù)變性2 min，93℃ 45 s，55℃ 60 s，10個(gè)循環(huán);93℃ 30 s，55℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)。計(jì)算機(jī)分析，確定基線和閾值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀取并計(jì)算各管DNA含量。

1.4 治療方法 對(duì)所有CA患者的疣體均采用CO2激光去除，待傷口愈合后外用干擾素凝膠，每周復(fù)查1次，術(shù)后隨訪3個(gè)月。肉眼疣體消失，無(wú)新發(fā)疣體出現(xiàn)為治愈，在原皮損處或鄰近部位有新疣體出現(xiàn)者為復(fù)發(fā)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，比較采用成組t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HPV6/11 DNA比較 在81例CA中，檢出HPV6/11型陽(yáng)性者77例(95.06%)。CA初發(fā)及復(fù)發(fā)者陰莖包皮組織中HPV6/11 DNA分別為(2.31×103～3.72 ×104)copies/mL 和(4.63 ×104～1.7×106)copies/mL，復(fù)發(fā)組高于初發(fā)組(t=-28.541，P ＜0.01)。HPV6/11 型高載量組(復(fù)發(fā)患者)30例(38.96%)，低載量組(初發(fā)患者)47例(61.04%)。

2.2 兩組外周血T細(xì)胞亞群比較 見表1。

表1 兩組外周血T細(xì)胞亞群比較(±s)

表1 兩組外周血T細(xì)胞亞群比較(±s)

組別 n CD+3(%) CD+4(%) CD+8(%) CD+4/CD+8 CA 組 81 62.83 ±9.11 31.74 ±8.53 30.67 ±8.39 1.19 ±0.73對(duì)照組 30 71.54 ±8.42 42.39 ±8.38 25.26 ±8.32 1.69 ±0.79 t 4.86 5.32 6.04 3.25 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 高載量與低載量組CA患者外周血T細(xì)胞亞群比較 見表2。

表2 高載量與低載量組CA患者外周血T細(xì)胞亞群比較( ± s)

表2 高載量與低載量組CA患者外周血T細(xì)胞亞群比較( ± s)

組別 n CD+3(%) CD+4(%) CD+8(%) CD+4/CD+8高載量組 30 62.32 ±8.52 29.73 ±6.87 32.76 ±8.46 0.89 ±0.65低載量組 47 62.89 ±9.12 32.97 ±5.64 29.84 ±7.31 1.13 ±0.72 t 1.32 4.87 4.39 3.96 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

HPV是一種DNA病毒，屬乳多空病毒科，是最小的DNA病毒，也是一種致瘤病毒，皮膚和黏膜上皮細(xì)胞是它的宿主細(xì)胞，具有感染及嗜鱗狀上皮的特性。病毒感染各種鱗狀上皮細(xì)胞后，具有促上皮增長(zhǎng)、促瘤形成的特性［1］，可引起上皮腫瘤或疣，是CA最重要的致病原因。HPV有100多種亞型，其中侵犯泌尿生殖系統(tǒng)的有20個(gè)型以上。CA與HPV6、11、16、18、31、33 型感染有關(guān)，其中 90%以上為HPV6/11亞型感染，少數(shù)為 HPV16/18亞型［2］。根據(jù)它們?cè)谏诚到y(tǒng)腫瘤形成中所發(fā)揮的不同作用，將HPV分為高危組(HPV16/18型等)和低危組(HPV6/11型)，高危組的病毒DNA通常整合到宿主基因中，其作用可能為啟動(dòng)癌基因［3］。而低危組的HPV病毒常誘發(fā)良性濕疣或?qū)m頸損傷，通常不整合到宿主基因中。CA是由HPV感染引起的，但與CA患者接觸后是否發(fā)病以及是否復(fù)發(fā)，在很大程度上取決于接觸者感染的病毒量及特異性免疫力，高載量的HPV對(duì)局部細(xì)胞免疫抑制作用相對(duì)加強(qiáng)，使機(jī)體難以有效清除病毒。Che等［4］研究認(rèn)為，復(fù)發(fā)性CA的HPV DNA明顯高于初發(fā)性CA，HPV DNA的載量隨著復(fù)發(fā)次數(shù)以及病程的增加而升高，二者呈正相關(guān)，故認(rèn)為病毒載量在CA的發(fā)病及復(fù)發(fā)中起著一定作用。De Marco等［5］研究了40例肛門生殖器CA患者，結(jié)果也表明HPV載量高的CA患者病程明顯長(zhǎng)于載量低者。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HPV DNA含量與其復(fù)發(fā)無(wú)明顯關(guān)系［6］。本研究81例標(biāo)本中，HPV6/11型陽(yáng)性檢出率95.06%，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道接近。復(fù)發(fā)組與初發(fā)組相比，兩組DNA載量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明病毒載量在CA的復(fù)發(fā)中起著一定的作用。

T細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，T細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫應(yīng)答是機(jī)體控制感染的關(guān)鍵［7］，它與NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等一起構(gòu)成了抗病毒免疫的主體，其表面的CD分子是T細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)功能的分子基礎(chǔ)，CA的發(fā)生、消退、復(fù)發(fā)及癌變與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，Th1/Th2細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)的互換，對(duì)CA的轉(zhuǎn)歸起著決定性作用。HPV感染后，機(jī)體存在特異性細(xì)胞免疫受抑制現(xiàn)象，不能建立有效的免疫反應(yīng)，是HPV持續(xù)感染的主要原因。Morelli等發(fā)現(xiàn)，感染HPV的生殖器皮損處主要有CD4+和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，且CD4+/CD8+下降，而在消退的皮損中，T細(xì)胞數(shù)量增加，主要為CD4+T細(xì)胞，CD4+/CD8+高于未消退的皮損，表明疣體消退時(shí)宿主細(xì)胞免疫功能恢復(fù)或增強(qiáng)。Kawana等也在HPV6 DNA陽(yáng)性的妊娠期CA患者母體、臍血和嬰兒血清中均檢測(cè)到了抗HPV6抗體，故認(rèn)為局部HPV感染導(dǎo)致局部的細(xì)胞免疫狀態(tài)改變，全身血液中感染有HPV，同樣也能引起全身細(xì)胞免疫狀態(tài)的改變。本研究通過(guò)檢測(cè)CA患者與正常人的外周血T淋巴細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)CA患者與正常人相比，外周血中CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞均低，而CD8+T細(xì)胞升高，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致，提示CA患者細(xì)胞免疫功能受到抑制。

CA復(fù)發(fā)率較高，常難徹底治愈。研究發(fā)現(xiàn)，CA復(fù)發(fā)與T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞免疫抑制相關(guān)聯(lián)，與病毒載量也有相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，高載量組患者CD4+T淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+較低載量組均降低，而CD8+T細(xì)胞升高，表明高載量組細(xì)胞免疫功能低于低載量組，進(jìn)一步說(shuō)明CA復(fù)發(fā)與患者T淋巴細(xì)胞亞群比例有關(guān)。

總之，CA患者復(fù)發(fā)者的病毒載量高于初發(fā)者，細(xì)胞免疫功能較正常人下降，且病毒載量高的CA患者細(xì)胞免疫功能低于病毒載量低者，為CA術(shù)后加用免疫調(diào)節(jié)劑治療、預(yù)防CA復(fù)發(fā)提供了理論依據(jù)。

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