于建超，王江平，李應(yīng)龍，錢彪，倪釗，王新敏，李強(qiáng)，王文曉，王勤章

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832000;2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

糖尿病膀胱異常病癥(DCP)為糖尿病末期常見的并發(fā)癥之一，發(fā)生率為19%～84%;其臨床表現(xiàn)為遺尿、尿不凈等，末期會(huì)出現(xiàn)尿路感染、腎炎等，最終發(fā)展成尿毒癥，發(fā)生機(jī)制目前尚不明確［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，膀胱逼尿肌會(huì)出現(xiàn)自發(fā)性收縮，此收縮完全受到Cajal樣細(xì)胞的調(diào)節(jié)［2］。DCP患者受高血糖的誘導(dǎo)，其Cajal樣細(xì)胞不斷萎縮或消失，致使Cajal樣細(xì)胞出現(xiàn)非特異性變異，導(dǎo)致干細(xì)胞因子(SCF)/c-kit信號(hào)表達(dá)功能減弱，膀胱感覺降低、收縮性減弱，膀胱剩余尿量增加等，最終導(dǎo)致DCP發(fā)生［3～8］。研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞白血病基因(SCL)屬于c-kit上端必不可少的調(diào)控基因，能夠有序開啟c-kit基因表達(dá)，促進(jìn)Cajal樣細(xì)胞表型及功能恢復(fù)［9～13］。重組慢病毒載體可發(fā)揮自主整合作用，以此在主細(xì)胞基因鏈中實(shí)現(xiàn)寄宿，在促進(jìn)主細(xì)胞分裂增殖的同時(shí)表達(dá)目的基因。本研究通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建含人SCL基因的重組慢病毒表達(dá)載體(GV287-SCL)，旨在為DCP的基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 含有SCL基因質(zhì)粒的綠色熒光蛋白(GFP)購自意大利瑞德基因研究所，感受態(tài)大腸桿菌DH5α、293T細(xì)胞、GV287-EGFP載體購自南京祥瑞基因公司，DMEM、FBS、轉(zhuǎn)染試劑盒 Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA片段提純試劑盒與DNA提取試劑盒購自日本QLAGEN生物研究中心，RTPCR試劑盒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，SDS-PAGE蛋白電泳儀及蛋白轉(zhuǎn)膜儀購自南京天能生物研究公司。

1.2 人SCL基因擴(kuò)增 對人SCL基因質(zhì)粒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，上游引物:5＇-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGACCGAGCGGCCGCCGAG-3＇，下 游引物:5＇-TCACCATGGTGGCGACCGGCCGAGGGCCGGCTCCATC-3＇，由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件:94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。取10 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3 穿梭質(zhì)粒GV287-EGFP/SCL的設(shè)計(jì) 提純包括人SCL基因的PCR擴(kuò)增因子，通過In-Fusion轉(zhuǎn)換酶的催化將靶基因的PCR產(chǎn)物與GV287-EGFP線性化載體進(jìn)行結(jié)合。

1.4 重組質(zhì)粒GV287-EGFP/SCL的篩選與鑒定提取含有人SCL基因的GV287-EGFP質(zhì)粒陽性克隆菌落PCR模板上的交換轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，長出菌落后加入10 μL培養(yǎng)基混勻。取1 μL設(shè)置模板，PCR法擴(kuò)增基因。上游引物:5＇-GGTATAAGAGGCGCGACCAG-3＇;下游引物:5＇-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3＇。反應(yīng)條件:94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸6 min。取10 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。與陽性轉(zhuǎn)化子對接，分裝，進(jìn)行排序測定。抽選8個(gè)轉(zhuǎn)化子，通過SCL引物對其進(jìn)行PCR檢測，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.5 重組慢病毒GV287-SCL的包裝、培養(yǎng)及鑒定培養(yǎng)293T細(xì)胞株作為包裝細(xì)胞，取1.5 mL滅菌EP 管，加入 1.5 μg 包裝質(zhì)粒和 0.5 μg 表達(dá)質(zhì)粒以及250 μL無血清培養(yǎng)基，混勻后室溫下孵育5 min;將9 μL 脂質(zhì)體、250 μL 無血清培養(yǎng)基置于1.5 mL EP試管中，輕輕震蕩混合，室溫下孵育5 min。將上述含DNA的溶液與脂質(zhì)體液均勻搖擺混合，室溫下孵育20 min。采用胰蛋白酶消化293T細(xì)胞并計(jì)數(shù)，置于有血清的培養(yǎng)液中。將上述 DNA、脂質(zhì)體混合物置于6孔培養(yǎng)板，給予1 mL含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。將1 mL 293T細(xì)胞懸掛，并置于6孔培養(yǎng)板，37℃CO2孵箱里孵化48～72 h，3 000 r/min離心20 min，過濾沉淀物，通過PVDF過濾膜篩選慢病毒原液。對含有病毒的血清進(jìn)行梯度稀釋分組(1∶100)，將其分為標(biāo)準(zhǔn)液與待測液，將兩種液體同時(shí)感染293T細(xì)胞，采用熒光標(biāo)記法計(jì)算病毒滴度［8］;提取293T細(xì)胞蛋白，采用Western blotting法檢測目的基因。

2 結(jié)果

2.1 人SCL基因擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定 PCR產(chǎn)物大小為1 036 bp，與目的基因相關(guān)片段中SCL cDNA大小相同，見圖1。

圖1 人SCL基因的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒GV287-EGFP/SCL陽性克隆鑒定陽性轉(zhuǎn)化子通過擴(kuò)展后，均形成503 bp條帶，其大小與目的片段人SCL cDNA相當(dāng);陰性轉(zhuǎn)化子得到192 bp條帶;見圖2。重組質(zhì)粒 GV287-EGFP/SCL陽性克隆測序結(jié)果顯示，目的基因SCL成功插入到GV287-EGFP，基因排序與GenBank信息庫里的人SCL基因mRNA基本相同。

2.3 重組慢病毒GV287-SCL鑒定及病毒滴度確定 重組慢病毒GV287-SCL作用293T細(xì)胞1天即觀察到細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)GFP表達(dá)。提取蛋白，采用Western blotting法檢測到72 kD附近出現(xiàn)特征條帶，其大小與SCL-GFP融合蛋白基本吻合。重組慢病毒在多次感染、外擴(kuò)和提純之后，滴度為5×108TU/mL。

圖2 重組質(zhì)粒GV287-EGFP/SCL陽性克隆電泳圖

3 討論

Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞控制膀胱逼尿肌的自發(fā)性興奮與收縮，屬于實(shí)際上的起搏介質(zhì)。Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)與其特異性酪氨酸激酶受體c-kit密切相關(guān)，通過對SCF/c-kit信號(hào)傳輸路徑激活，維持Cajal細(xì)胞的外型和生理特性。SCL基因異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致急性T淋巴細(xì)胞白血病，且SCL與造血和血管內(nèi)皮發(fā)育有關(guān)。SCL屬于多因素復(fù)合體的轉(zhuǎn)化因子，能夠增強(qiáng)ckit誘導(dǎo)因子的活性，但不會(huì)影響單核細(xì)胞開啟活性的變化［14］。鑒于SCL在Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵作用，如果通過基因技術(shù)組建人SCL基因重組慢病毒載體，將SCL基因轉(zhuǎn)染Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞，增加 SCL的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞表型和功能的恢復(fù)［15］，可為進(jìn)一步探究DCP的基因治療提供理論依據(jù)。

慢病毒作為基因治療的一個(gè)常規(guī)介質(zhì)，可以有效且針對性地對分裂或非分裂細(xì)胞實(shí)現(xiàn)感染，將外源基因有效導(dǎo)入寄主細(xì)胞的細(xì)胞核上，具有周期長、特性穩(wěn)固、表達(dá)顯著等特點(diǎn)，能夠用來開展體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。本研究采用的慢病毒包裝系統(tǒng)是三質(zhì)粒包裝，其中包含1個(gè)表達(dá)載體，含有目的基因、報(bào)告基因GFP、目的基因的啟動(dòng)子以及其他病毒包裝所需的必要元件;另外包含2個(gè)輔助質(zhì)粒的包裝質(zhì)粒，表達(dá)產(chǎn)生包裝病毒所需的結(jié)構(gòu)蛋白。表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒形成反式互補(bǔ)，且包裝質(zhì)粒又分別由2個(gè)質(zhì)粒構(gòu)成，安全性得到保障。GFP是一種在藍(lán)色光激發(fā)下會(huì)發(fā)出穩(wěn)定綠色熒光的生物熒光蛋白，無細(xì)胞毒性，現(xiàn)已作為標(biāo)記分子或報(bào)告基因被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)和活體組織的檢測。本實(shí)驗(yàn)選用GFP作為慢病毒的標(biāo)記基因，GFP熒光具有穩(wěn)定且清晰可見的優(yōu)點(diǎn)，在熒光顯微鏡下可以對活細(xì)胞進(jìn)行定時(shí)、定位的觀察，實(shí)驗(yàn)中可隨時(shí)觀察三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞生成病毒的情況，準(zhǔn)確、直觀觀察結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對其進(jìn)行反復(fù)濃縮、純化，得到高滴度慢病毒原液，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后測定目的基因表達(dá)，并采用熒光法標(biāo)定病毒滴度。結(jié)果表明慢病毒滴度為5×108TU/mL，可滿足大多數(shù)轉(zhuǎn)染相關(guān)實(shí)驗(yàn)需求［14，15］。

本研究運(yùn)用基因工程技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)，成功制備了人體SCL基因重組慢病毒載體GV287-SCL，慢病毒滴度為5×108TU/mL;上述結(jié)果為繼續(xù)進(jìn)行該基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染及開展DCP的基因治療奠定了基礎(chǔ)。

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