何泳志，李大文，成俊萍，萬里凱，肖鑫，龔國(guó)通

(1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧530021;2廣西中醫(yī)藥大學(xué))

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)預(yù)測(cè)，不孕不育將成為僅次于腫瘤和心腦血管疾病的第三大疾?。?］。在不孕不育原因中，男性因素約占40%。梗阻性無精子癥(OA)是男性不育的常見原因，卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)是其常用的治療措施。為獲得更好的精子助孕，我們對(duì)比分析了OA患者睪丸與附睪精子DNA完整性、頂體完整率和反應(yīng)率的差異。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 入選標(biāo)準(zhǔn):①年齡20～40歲;②精液常規(guī)檢查≥3次，離心后確認(rèn)精子數(shù)為0;③性激素檢查促卵泡激素(FSH)基本正常;④睪丸體積＞30 mL或單側(cè)體積＞15 mL，睪丸活檢存在精子;⑤排除其他原因?qū)е碌牟挥?⑥需行ICSI助孕者。選擇2012年6月～2014年12月廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院收治的符合入選標(biāo)準(zhǔn)的OA患者240例，其中經(jīng)睪丸取精110例(A組)、附睪取精140例(B組)。A 組年齡(28.56 ±2.18)歲，睪丸體積(29.92±2.09)mL，血清睪酮(519.04 ±92.08)ng/dL、FSH(7.04 ±2.36)IU/L;B 組年齡(28.81 ±2.31)歲，睪丸體積(29.84 ±2.07)mL，血清睪酮(522.33 ±88.03)ng/dL、FSH(7.37 ±2.22)IU/L;兩組臨床資料具有可比性，P均＞0.05。

1.2 方法

1.2.1 取精方法 A組行經(jīng)皮睪丸精子抽吸術(shù)(TESA)。患者取仰臥位，常規(guī)消毒、鋪巾。術(shù)者左手固定一側(cè)睪丸，用1%利多卡因行精索阻滯，在穿刺點(diǎn)亦行局麻。術(shù)者右手握帶側(cè)孔的12號(hào)針經(jīng)皮穿刺進(jìn)入睪丸，由助手用60 mL注射器吸取精子洗滌液2 mL，接上針頭后抽吸，直至吸出組織，移入含精子洗滌液的培養(yǎng)皿中。磨碎精曲小管，在倒置顯微鏡下觀察精子。如找不到精子，可改變方向再次穿刺，甚至穿刺另一側(cè)睪丸。B組行經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)(PESA)。術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉同 TESA。用5 mL注射器吸入少量培養(yǎng)液，直視下用4號(hào)半針頭經(jīng)皮穿刺附睪，負(fù)壓抽吸至有淡黃渾濁液體抽出。如未見液體被抽出，可改變穿刺方向重復(fù)抽吸。將抽吸出的液體注入含精子洗滌液的培養(yǎng)皿，在倒置顯微鏡下尋找活動(dòng)的成熟精子。若提取液中無精子或無活動(dòng)精子，則行對(duì)側(cè)附睪穿刺。若附睪穿刺無精子，考慮行TESA。

1.2.2 精子DNA完整性觀察 采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)［2］，進(jìn)行瑞氏—姬姆薩染色。計(jì)數(shù)400個(gè)精子，普通顯微鏡下觀察精子光暈大小。根據(jù)光暈與精子頭部橫徑的比例，將精子粗分為大(＞2/3)、中(1/4～2/3)、小(≤1/4)光暈和無光暈4個(gè)等級(jí)。大光暈、中光暈表示精子DNA完整無碎片，小光暈、無光暈和退化精子表示精子DNA斷裂為碎片。以精子DNA斷裂指數(shù)(DFI)表示DNA完整性，DFI越大完整性越差。DFI=(小光暈精子+無光暈精子+退化精子)/精子總數(shù)×100%。

1.2.3 精子頂體完整率及反應(yīng)率測(cè)定 以豌豆凝集素進(jìn)行染色，用異硫氰酸熒光素進(jìn)行標(biāo)記，用450～490 nm激發(fā)光，于1 000倍油鏡下觀察涂片。精子頂體完整(AI)為精子頭部一半以上熒光染色明亮且均勻;精子發(fā)生頂體反應(yīng)(AR)為精子僅在赤道帶出現(xiàn)熒光帶，或者在頂體區(qū)根本沒有熒光染色。每張圖片精子計(jì)數(shù)200條，用血球分類計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)AI和AR的數(shù)目，計(jì)算2張重復(fù)涂片AI和AR所占比率。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組DFI、精子頂體完整率、反應(yīng)率比較見表1。

表1 兩組DFI、精子頂體完整率、反應(yīng)率比較(%， ± s)

表1 兩組DFI、精子頂體完整率、反應(yīng)率比較(%， ± s)

注:與 B 組比較，*P ＜0.05。

組別 n DFI 精子頂體完整率 精子頂體反應(yīng)率A 組 110 31.76 ±23.60 48.39 ±22.46*9.72 ±8.88 B組140 31.17 ±23.47 40.10 ±20.77 9.44 ±8.33

3 討論

大量研究表明，精子DNA和染色質(zhì)的損傷與男性不育和女性自然受孕率低明顯關(guān)聯(lián)［3，4］。DFI與ICSI助孕時(shí)繼續(xù)妊娠率呈負(fù)相關(guān)，且高水平DFI與ICSI植入率明顯相關(guān)［5］。但是，精子DNA區(qū)域損傷與受精率降低、植入失敗、流產(chǎn)、嬰兒出生缺陷的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議［6，7］。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在體外受精過程中，精子染色質(zhì)只與胚胎質(zhì)量有關(guān)，與受精率、妊娠率無關(guān)［8］。正常情況下，在核中的精子因有特殊結(jié)構(gòu)DNA非常穩(wěn)定。精子DNA損傷最重要的機(jī)制是不正常的染色質(zhì)包裝、活性氧和凋亡，外界環(huán)境因素包括陰囊溫度過高、吸煙、生殖道感染等。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組DFI并無差異，提示取精部位不影響DNA完整性。其可能與以下原因有關(guān):①精子發(fā)生經(jīng)過在睪丸、附睪內(nèi)一系列成熟和修飾過程，不同來源的精子在畸形率、DNA和染色體異常、成熟度和印記基因等方面差異較大。②精子在睪丸尚呈精原細(xì)胞狀態(tài)，仍是未成熟精子，精子活力差甚至是不動(dòng)精子;附睪中精子由于慢性炎癥介質(zhì)，梗阻淤積導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷。因此，OA患者睪丸與附睪精子DNA完整性無顯著差異。

精子頂體是高爾基體衍生而來的帽狀細(xì)胞器，覆蓋在精子核的前2/3區(qū)。在受精過程中發(fā)生頂體反應(yīng)是一個(gè)基本步驟，頂體膜和細(xì)胞質(zhì)膜混合形成的囊泡在細(xì)胞外釋放頂體酶，頂體酶上覆在精子頭部，使精子穿透卵母細(xì)胞進(jìn)行受精［9～11］。睪丸精子已初步發(fā)育，并具功能活性的頂體蛋白酶，進(jìn)入附睪后頂體蛋白酶逐漸發(fā)育至功能成熟，而曲細(xì)精管和附睪管內(nèi)液體存在抑制酶活性物質(zhì)［12］。Michailov等［13］研究發(fā)現(xiàn)，鋅離子刺激精子獲能和頂體反應(yīng)是由表皮生長(zhǎng)因子受體激活的，細(xì)胞外鋅通過MAP1激酶通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖;在一部分細(xì)胞可作為信號(hào)分子，通過其受體調(diào)節(jié)精子多個(gè)信號(hào)通路，使精子獲能和發(fā)生頂體反應(yīng)。因此，精子頂體反應(yīng)率、頂體酶活力及精子膜功能完整性是評(píng)價(jià)精子功能的重要指標(biāo)，且精子頂體完整率與頂體內(nèi)酶的含量及活力明顯相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，行ICSI時(shí)發(fā)生頂體反應(yīng)，精子植入率升高，且可能更有利于胚胎的質(zhì)量［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，睪丸與附睪精子行ICSI時(shí)頂體反應(yīng)率無明顯差異，提示取精部位不影響DNA頂體反應(yīng)。其與以下原因有關(guān):①OA患者無論睪丸或附睪精子，其整體精子功能質(zhì)量均較差，包括精子活力、精子正常形態(tài)、DNA完整性等，導(dǎo)致精子結(jié)合卵透明帶后，在卵透明帶上發(fā)生頂體反應(yīng)均受到影響。②睪丸及附睪精子頂體酶由于自身不穩(wěn)定，發(fā)生自發(fā)頂體反應(yīng)，導(dǎo)致兩者所檢測(cè)到的頂體反應(yīng)率無顯著差異。

有文獻(xiàn)報(bào)道，精子頂體完整率與正常形態(tài)精子百分率、精子活率、精子活力均呈正相關(guān)［15］。有研究報(bào)道，在輸精管梗阻時(shí)，梗阻下段附睪管腔內(nèi)壓力增高，精子成熟的局部微環(huán)境穩(wěn)態(tài)受到破壞;進(jìn)一步引起附睪蛋白P34h表達(dá)和轉(zhuǎn)錄障礙，導(dǎo)致其合成和分泌受阻，最終影響精子的成熟及功能的獲得［16，17］。OA患者附睪精子中可觀察到大量精子小頭、小頂體、梨形頭、錐形頭以及尾部缺陷精子，精子頭部大量空泡出現(xiàn)可能是精子在梗阻盲端淤積、降解所致。研究發(fā)現(xiàn)，OA患者附睪精子頂體PSA染色熒光染色不均勻，且形態(tài)學(xué)檢測(cè)顯示其附睪精子頭部有大量空泡以及顯著的精子形態(tài)異常［18］。本研究顯示，睪丸精子頂體完整率高于附睪精子，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其可能原因:①OA多為炎性梗阻，常見的慢性附睪炎可導(dǎo)致附睪纖維化、功能喪失，長(zhǎng)期梗阻淤積導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，有礙于附睪內(nèi)精子成熟、發(fā)育［19］。②附睪內(nèi)炎性物質(zhì)、淤血及組織碎片等易導(dǎo)致精子損傷。由于OA患者睪丸精子頂體完整率優(yōu)于附睪精子，所以行ICSI結(jié)局可能會(huì)優(yōu)于附睪精子。

［1］程可佳，劉強(qiáng)，黎杰運(yùn).橘核丸治療少弱精子癥臨床機(jī)理探討［J］.中國(guó)臨床實(shí)用醫(yī)學(xué)，2007，1(5):27-31.

［2］Fernandez JL，Muriel L，Rivero ML，et al.The sperm chroma dispersion test:a simple method for the determination sperm DNA fragmentation ［J］.J Androl，2003，24(1):59-66.

［3］Giwercman A，Lindstedt L，Larsson M，et al.Sperm chromatin structure assay as an independent predictor of fertility in vivo:a case-controlstudy［J］.Int J Androl，2010，33(1):221-227.

［4］張洲，師娟子，邢俊平，等.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與精液常規(guī)參數(shù)、精子畸形率和DNA完整性的相關(guān)性［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(16):1788-1792.

［5］Speyer BE，Pizzey AR，Ranieri M ，et al.Fall in implantation rates following ICSI with sperm with high DNA fragmentation［J］.Hum Reprod，2010，25(7):1609-1618.

［6］Lewis SE，John Aitken R，Conner SJ，et al.The impact of sperm DNA damage in assisted conception and beyond:recent advances in diagnosis and treatment［J］.Reprod Biomed Online，2013，27(4):325-337.

［7］Bungum M，Humaidan P，Axmon A，et al.Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome［J］.Hum Reprod，2007，22(1):174-179.

［8］Niu ZH，Shi HJ，Zhang HQ，et al.Sperm chromatin structure assay results after swim-up are related only to embryo quality but not to fertilization and pregnancy rates following IVF［J］.Asian J Androl，2011，13(6):862-866.

［9］Sosa CM，Pavarotti MA，Zanetti MN，et al.Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis［J］.Mol Hum Reprod，2015，21(3):244-254.

［10］Guyonnet B，Egge N，Cornwall GA.Functional amyloids in the mouse sperm acrosome［J］.Mol Cell Biol，2014，34(14):2624-2634.

［11］Sawada H，Yokosawa H，Someno T，et al.Evidence for the participation of two sperm proteases，spermosin and acrosin，in fertilization of the ascidian，Halocynthia roretzi:Inhibitory effects of leupeptin analogs on enzyme activities and fertilization［J］.Dev Biol，1984，105(1):246-249.

［12］Zini A，Phillips S，Courchesne A，et al.Sperm head morphology is relatedto high deoxyribonucleic acid stainability assessed by sperm chromatinstructure assay［J］.Fertil Steril，2009，91(6):2495-2500.

［13］Michailov Y，Ickowicz D，Breitbart H.Zn2+-stimulation of sperm capacitation and of the acrosome reaction is mediated by EGFR activation［J］.Dev Biol，2014，396(2):246-255.

［14］Gianaroli L，Magli MC，F(xiàn)erraretti AP，et al.Birefringence characteristics in sperm heads allow for the selection of reactedspermatozoa forintracytoplasmic sperm injection［J］.Fertil Steril，2010，93(3):807-813.

［15］李大文，孟繁華，韓偉.精子頂體完整率對(duì)男性生育功能的影響［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(15):71-72.

［16］Brandenburger T，Strehler EE，F(xiàn)iloteo AG，et al.Switch of PMCA4 splice variants in bovine epididymis results in alteredisoform expression during functional sperm maturation［J］.J Biol Chem，2010，14(8):27-33.

［17］鄧仲磊，程歡，徐東亮，等.梗阻性無精子癥患者附睪蛋白P34h的表達(dá)及其意義［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，32(1):58-61.

［18］張希，朱偉杰，龍曉林，等.梗阻性無精子癥患者精子頂體完整性與卵胞質(zhì)單精子注射治療結(jié)局之間的關(guān)系［J］.生殖與避孕，2013，33(4):228-232.

［19］王鴻祥，陳斌，胡凱，等.梗阻性無精子癥患者附睪精子DNA損傷與卵胞漿內(nèi)單精子注射治療結(jié)局的相關(guān)性研究［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，32(8):983-987.