饒和平，金祥寧，盧偉力，彭曉蓉，靳昌忠

（1衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 衢州 324000;2金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院;3衢州市人民醫(yī)院;4浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院）

不育-α-基序結(jié)構(gòu)域和組氨酸/天冬氨酸殘基雙聯(lián)體結(jié)構(gòu)域包涵蛋白1（SAMHD1）是一種最新發(fā)現(xiàn)的HIV-1宿主限制因子，它高表達(dá)于髓系細(xì)胞，如樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，而在HIV-1容易感染的CD+4T 細(xì)胞中的表達(dá)卻較低［1，2］。SAMHD1 是一種dGTP依賴(lài)的磷酸水解酶，能夠?qū)NTPs水解成脫氧核苷和無(wú)機(jī)的三磷酸，從而降低細(xì)胞中dNTP水平，起到清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)剩的dNTPs的作用［3］。HIV-1感染細(xì)胞后，病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成病毒DNA，這時(shí)需要大量的dNTP，SAMHD1通過(guò)耗竭細(xì)胞內(nèi)的dNTP使病毒的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程受阻，從而限制病毒的感染［4］。同時(shí)，SAMHD1也是目前已知惟一的HIV-1無(wú)法對(duì)抗的宿主限制因子。因此，SAMHD1的表達(dá)對(duì)HIV-1的感染及潛伏的形成十分重要。體外實(shí)驗(yàn)表明，SAMHD1的表達(dá)受干擾素 （IFN-α）調(diào)控，干擾素可以顯著促進(jìn)SAMHD1的表達(dá)［5］。HIV-1感染可以產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的分泌，包括 IFN-α 水平的升高［6］。HIV-1 感染者 SAMHD1 mRNA的變化及其與IFN-α水平的關(guān)系目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察了HIV-1感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中SAMHD1 mRNA，并分析了其與血漿IFN-α水平的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年5～10月于浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的HIV-1感染者78例，其中32例未接受抗病毒治療，男22例，女10例;年齡（37.8±7.6）歲;46例接受高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（HAART）1 a以上，男33例、女13例，年齡（35.93±11.57）歲，治療時(shí)間（3.1 ±1.2）a;所有 HIV-1 感染者均經(jīng)初篩和確認(rèn)試驗(yàn)HIV-1抗體陽(yáng)性，近期無(wú)機(jī)會(huì)性感染或腫瘤以及HBV/HCV合并感染。另外招募正常對(duì)照者 28例，男21例、女7例，年齡（38.29±12.51）歲。各組一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。本研究得到浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究方案均告知患者本人，并簽訂知情同意書(shū)。

1.2 PBMC中SAMHD1 mRNA檢測(cè) 每位受試對(duì)象抽取EDTA抗凝血5 mL，用于PBMC分離、流式細(xì)胞術(shù)和病毒載量檢測(cè)。采用密度梯度離心法（Ficoll淋巴細(xì)胞分離液）分離上述抗凝血，得到PBMC。用TRIzol溶液溶解上述細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)，提取總體RNA。取1 μL RNA，利用 PrimeSciptTM逆轉(zhuǎn)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用20 μL反應(yīng)體系，取1 μL cDNA反應(yīng)產(chǎn)物，加入SYBR定量檢測(cè)混合試劑中，利用Light Cycler2.0定量PCR儀擴(kuò)增、檢測(cè)。反應(yīng)條件:先在95℃反應(yīng)30 s，再在95℃、5 s和60℃、20 s條件下反應(yīng)40循環(huán)。利用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算SAMHD1 mRNA。

1.3 血漿 IFN-α 水平檢測(cè) 采用人 IFN-α ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血漿IFN-α水平，操作按照說(shuō)明書(shū)所述步驟進(jìn)行。

1.4 血漿HIV病毒載量檢測(cè) 采用HIV-1 Monitor 1.5（Roche）商品化試劑盒，在COBAS Amplisemsor-PCR儀上對(duì)血漿樣品的HIV-RNA作定量分析，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，結(jié)果以每毫升血漿含病毒拷貝數(shù)表示，最低檢測(cè)限50拷貝/mL。

1.5 外周血CD+4、CD+8T細(xì)胞數(shù)檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀和CD3/CD4/CD8三色標(biāo)記單抗絕對(duì)定量試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，取全血50 μL，用20 μL單克隆抗體混合物孵育1 h，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞之后上機(jī)檢測(cè)。用System U軟件進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，采用單因素方差分析對(duì)多組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中兩兩比較采用LSD法。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組PBMC中 SAMHD1 mRNA及血漿 IFN-α水平比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組PBMC中SAMHD1 mRNA及血漿IFN-α水平比較（ ± s）

表1 各組PBMC中SAMHD1 mRNA及血漿IFN-α水平比較（ ± s）

注:與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.01。

組別 n SAMHD1 mRNA IFN-α治療組 46 1 278±276* 67.5±15.7*未治療組 32 1 422±319* 51.6±10.3*正常對(duì)照組28 684±183 27.2± 9.1

2.2 各組血漿HIV病毒載量及外周血CD+4T細(xì)胞、CD+8T細(xì)胞數(shù)比較 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組血漿HIV病毒載量及外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表2 各組血漿HIV病毒載量及外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞數(shù)比較（±s）

注:與未治療組比較，*P ＜0.05;與正常對(duì)照組比較，△P ＜0.05。

組別 n 病毒載量（log10）CD+4T細(xì)胞數(shù)CD+8T細(xì)胞數(shù)（個(gè)/μL）（個(gè)/μL）治療組 46 0.81 ±1.25* 452.05 ±161.20＊△835.88 ±370.36未治療組 32 4.44 ±0.93 325.17±188.83△ 1 056.81±523.02正常對(duì)照組28 - 693.52 ±148.26 983.46 ±508.94

2.3 相關(guān)性分析 HIV-1感染者PBMC中SAMHD1 mRNA與病毒載量、CD+4T細(xì)胞數(shù)量無(wú)相關(guān)性（r分別為 -0.306、0.064，P均 ＞ 0.05），與血漿IFN-α 水平呈正相關(guān)（r=0.324，P＜0.05）。

3 討論

固有免疫和獲得性免疫在抗HIV-1及其機(jī)會(huì)性感染中發(fā)揮了重要作用，特別是固有免疫，是近年來(lái)抗HIV-1感染免疫研究的熱點(diǎn)。SAMHD1在固有免疫系統(tǒng)中扮演重要角色。SAMHD1功能的缺失可以造成細(xì)胞內(nèi)dNTPs的大量積聚，從而引發(fā)強(qiáng)烈的免疫活化和大量的 Ⅰ 型干擾素分泌［7，8］。因此，SAMHD1這種通過(guò)清除過(guò)剩的dNTPs來(lái)減少核酸代謝引起的免疫活化的能力，使它與固有免疫反應(yīng)緊密地聯(lián)系起來(lái)，又被形象地稱(chēng)為“IFN反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)器”［7，9］。SAMHD1 對(duì)固有免疫應(yīng)答的調(diào)控在HIV-1感染中的作用尚不清楚。一方面，SAMHD1對(duì)Ⅰ型干擾素分泌的抑制作用可能促進(jìn)HIV-1的感染;另一方面，SAMHD1通過(guò)避免免疫系統(tǒng)過(guò)度活化以減少CD+4T細(xì)胞的活化和HIV-1的感染。此外，SAMHD1還是HIV-1感染的重要宿主限制因子。HIV-1難以有效感染DC、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等髓系細(xì)胞的主要原因是這些髓系細(xì)胞高表達(dá)SAMHD1［4，10］。敲除 SAMHD1 基因后，這些髓系細(xì)胞就喪失了對(duì)HIV-1感染的抵抗性，可以被HIV-1大量感染［11］。SAMHD1對(duì)HIV-1感染的限制是通過(guò)降低HIV-1逆轉(zhuǎn)錄所需的原料dNTPs的濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)的［12］。SAMHD1基因缺陷的AGS患者的單核細(xì)胞更容易感染HIV-1，進(jìn)一步在人體原代細(xì)胞上驗(yàn)證了 SAMHD1 的 HIV-1 感染限制功能［13，14］。

SAMHD1在固有免疫調(diào)控及HIV-1感染中的重要作用。本研究顯示，HIV-1感染者PBMC中SAMHD1表達(dá)及 IFN-α水平升高，SAMHD1表達(dá)與IFN-α水平呈正相關(guān)，而與CD+4T細(xì)胞數(shù)量和病毒載量無(wú)關(guān)。SAMHD1在抑制Ⅰ型干擾素過(guò)度分泌的同時(shí)，其自身的表達(dá)又受干擾素的調(diào)控。SAMHD1最初是作為一種IFN-γ誘導(dǎo)的蛋白被發(fā)現(xiàn)的［15］。此外，有報(bào)道［16］IFN-α 也可以誘導(dǎo) SAMHD1的表達(dá)。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，IFN-γ可以在 THP-1和Jurkat細(xì)胞上誘導(dǎo)SAMHD1的表達(dá)［17］。這樣，SAMHD1與干擾素形成了一個(gè)互相調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。Buitendijk等在研究Toll樣受體（TLRs）的免疫應(yīng)答時(shí)發(fā)現(xiàn)，TLR9活化時(shí)伴有SAMHD1表達(dá)的升高。結(jié)合TLRs在病毒感染免疫應(yīng)答中的重要作用，HIV-1感染是否可以通過(guò)TLRs通路調(diào)控SAMHD1?本研究結(jié)果提示，HIV-1感染上調(diào)SAMHD1表達(dá)的機(jī)制可能是通過(guò)IFN-α的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。HIV-1感染靶細(xì)胞后，可以通過(guò)與Toll樣受體結(jié)合，促進(jìn)IFN-α以及多種促炎因子的表達(dá)，而IFN-α水平的升高又可以上調(diào)SAMHD1的表達(dá)，來(lái)抑制免疫系統(tǒng)的過(guò)度激活，同時(shí)抑制HIV-1感染新的靶細(xì)胞。

［1］St Gelais C，Wu L.SAMHD1:a new insight into HIV-1 restriction in myeloid cells［J］.Retrovirology，2011，（8）:55.

［2］Jermy A.Viral infection:SAMHD1 cuts the power to HIV-1［J］.Nat Rev Microbiol，2012，10（4）:237.

［3］ Powell RD，Holland PJ，Hollis T，et al.Aicardi-Goutieres syndrome gene and HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a dGTP-regulated deoxynucleotide triphosphohydrolase［J］.J Biol Chem，2011，286（51）:43596-43600.

［4］Lahouassa H，Daddacha W，Hofmann H，et al.SAMHD1 restricts the replication of human immunodeficiency virus type 1 by depleting the intracellular pool of deoxynucleoside triphosphates［J］.Nat Immunol，2012，13（3）:223-228.

［5］Goujon C，Schaller T，Gal?o RP，et al.Evidence for IFN-α-induced，SAMHD1-independent inhibitors of early HIV-1 infection［J］.Retrovirology，2013，（10）:23.

［6］Tremblay MJ.HIV-1 and pattern-recognition receptors:a marriage of convenience［J］.Nat Immunol，2010，11（5）:363-365.

［7］Rice GI，Bond J，Asipu A，et al.Mutations involved in aicardigoutières syndrome implicate SAMHD1 as regulator of the innate immune response［J］.Nat Genet，2009，41（7）:829-832.

［8］ Goldstone DC，Ennis-Adeniran V，Hedden JJ，et al.HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase［J］.Nature，2011，480（7377）:379-382.

［9］Laguette N，Benkirane M.How SAMHD1 changes our view of viral restriction［J］.Trends Immunol，2012，33（1）:26-33.

［10］Jamburuthugoda VK，Chugh P，Kim B.Modification of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase to target cells with elevated cellular dNTP concentrations［J］.J Biol Chem，2006，281（19）:13388-13395.

［11］Laguette N，Sobhian B，Casartelli N，et al.SAMHD1 is the dendritic and myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx［J］.Nature，2011，474（7353）:654-657.

［12］Amie SM，Noble E，Kim B.Intracellular nucleotide levels and the control of retroviral infections［J］.Virology，2013，436（2）:247-254.

［13］Berger A，Sommer AF，Zwarg J，et al.SAMHD1-deficient CD+14cells from individuals with aicardi-goutieres syndrome are highly susceptible to HIV-1 infection［J］.PLoS Pathog，2011，7（12）:e1002425.

［14］Goncalves A，Karayel E，Rice GI，et al.SAMHD1 is a nucleicacid binding protein that is mislocalized due to aicardi-goutières syndrome-associated mutations［J］.Hum Mutat，2012，33（7）:1116-1122.

［15］Li N，Zhang W，Cao X.Identification of human homologue of mouse IFN-gamma induced protein from human dendritic cells［J］.Immunol Lett，2000，74（3）:221-224.

［16］ Su B，Biedma M，Lederle A，et al.Dendritic cell-lymphocyte cross talk downregulates host restriction factor SAMHD1 and stimulates HIV-1 replication in dendritic cells［J］.J Virol，2014，88（9）:5109-5121.

［17］Jin C，Peng X，Liu F，et al.MiR-181 expression regulates specific post-transcriptional level of SAMHD1 expression in vitro［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，452（3）:760-767.