涂濤，董蜀華

（成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，成都 610500）

帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛（PHN）是中、老年人群的多發(fā)病之一，是公認(rèn)的世界級(jí)疼痛頑疾。至今尚不清楚導(dǎo)致PHN的真正原因，但在神經(jīng)病理性疼痛中，神經(jīng)元線粒體功能障礙已成為共識(shí)的早期病理現(xiàn)象，而線粒體的形態(tài)和功能又與線粒體泛素連接酶（MITOL）息息相關(guān)［1］。PHN本身就是一種神經(jīng)病理性疼痛，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)MITOL與PHN的相關(guān)性報(bào)道較少。本研究通過建立大鼠PHN模型，以脊髓背角為靶點(diǎn)，運(yùn)用行為學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法，研究脊髓背角組織中MITOL的表達(dá)變化及其與痛行為的相關(guān)性，以探尋PHN的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SD大鼠50只，2月齡，體質(zhì)量180～200 g，由成都醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有大鼠隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組各25只。

1.2 模型制備 將SD大鼠置于安靜、18～22℃環(huán)境中，正常喂養(yǎng)48 h以上。觀察組按照2004年Dalzial等［2］方法建立水痘帶狀皰疹病毒（VZV）慢性感染的動(dòng)物模型。首先將CV-1細(xì)胞（非洲綠猴腎母纖維細(xì)胞）加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基中制成細(xì)胞懸液，按5×104/cm2接種于培養(yǎng)瓶，再用VZV感染CV-1細(xì)胞，2 d后當(dāng)大約有80%的細(xì)胞被感染時(shí)，用磷酸鹽緩沖溶液收集被感染細(xì)胞，制成的細(xì)胞懸液即為病毒接種溶液，最后將50 μL（經(jīng)測(cè)定大約包含6×106個(gè)被感染細(xì)胞）接種溶液注入SD大鼠左趾璞。對(duì)照組大鼠左趾璞注射同等劑量的0.9%氯化鈉液。所有動(dòng)物在飼養(yǎng)期間自由攝食和飲水，且均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)范》。各組大鼠注射前及注射后 3、7、14、21 d檢測(cè)大鼠左后足 PWTL、MWT［3］，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè) 5 只大鼠，并且在上午8:00～11:00進(jìn)行。VZV感染后3天大鼠開始出現(xiàn)熱痛敏閾值和機(jī)械痛敏閾值異?？膳卸ㄖ颇３晒?。

1.3 大鼠脊髓背角組織MITOL檢測(cè) 采用Western blotting法。在注射前及注射后 3、7、14、21 d 每組取5只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）深度麻醉，冰上處死后取出腰膨大節(jié)段脊髓背角組織，提取蛋白。Bradford法定量后，制備SDSPAGE膠，上樣電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后牛奶封閉。然后分別加入MITOL抗體和β-actin抗體4℃過夜，漂洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h。按照發(fā)光試劑盒說明書進(jìn)行放射自顯影，并使用Flurochem 9900-50凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶光密度，以MITOL與內(nèi)參β-actin強(qiáng)度的比值作為結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組大鼠脊髓背角組織MITOL表達(dá)比較見表1。

表1 兩組大鼠脊髓背角組織MITOL表達(dá)比較（±s）

表1 兩組大鼠脊髓背角組織MITOL表達(dá)比較（±s）

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與同組注射前比較，△P ＜0.01。

組別21 d觀察組 13.18±1.14 37.52±3.51＊△ 56.08±4.03＊△ 68.43 ±4.17＊△ 52.61±3.37 MITOL注射前 注射3 d 注射7 d 注射14 d 注射＊△對(duì)照組 13.62 ±0.81 12.98 ±0.89 13.11 ±1.02 13.24 ±0.9612.83 ±0.95

3 討論

PHN是帶狀皰疹最常見的并發(fā)癥，其發(fā)生率隨年齡的增長(zhǎng)而增加，多有痛覺過敏和痛覺異常，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［4］。目前，對(duì)于PHN的治療雖然有多種方法，但治療效果均不佳。因此，亟待對(duì)PHN發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入探索，以便能為有效預(yù)防或治療此病藥物或方法的研究提供理論依據(jù)。

眾所周知，脊髓背角是傳遞外周傷害性信息的主要終止部位，也是下行抑制系統(tǒng)的終止部位之一。因此，脊髓背角是對(duì)痛信息進(jìn)行加工、處理、整合的初級(jí)中樞，是研究痛與鎮(zhèn)痛機(jī)制的突破口之一，可以說是痛覺傳導(dǎo)的一個(gè)關(guān)鍵部位。所以，對(duì)于闡明線粒體功能障礙在脊髓水平參與痛和鎮(zhèn)痛的機(jī)制而言，脊髓背角是理想的研究靶區(qū)［5］。帶狀皰疹并發(fā)PHN者存在脊髓背角損害，可見脊髓及以上水平可能也參與了PHN的發(fā)生發(fā)展。說明PHN的發(fā)生與周圍及中樞神經(jīng)的損害均有關(guān)，并且認(rèn)為VZV通過直接感染脊髓或跨突觸變形導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，可能在PHN的發(fā)生中也起了關(guān)鍵作用［6］。

在細(xì)胞中，線粒體不是一成不變的，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)、數(shù)量和位置都處于一種動(dòng)態(tài)的變化之中。其中分裂和融合是線粒體形態(tài)變化的兩個(gè)主要方面，通過這種均衡來維持線粒體的形態(tài)和功能［7］，是維持線粒體氧化磷酸化的必需條件［8］。介導(dǎo)融合的關(guān)鍵蛋白是線粒體融合蛋白2，它是線粒體外膜上的跨膜GTP酶;而動(dòng)力相關(guān)蛋白1重點(diǎn)參與線粒體的分裂。線粒體結(jié)構(gòu)完整性與線粒體功能密切相關(guān)，線粒體結(jié)構(gòu)破壞可直接影響線粒體膜電位、ATP合成等功能。值得注意的是，線粒體分裂和融合的動(dòng)態(tài)平衡主要受到 MITOL 的調(diào)節(jié)［9，10］。MITOL 又名膜相關(guān)RING CH5，自2005年被發(fā)現(xiàn)以來，一直倍受關(guān)注。MITOL由278個(gè)氨基酸組成，位于線粒體外膜上，在C-端含有4個(gè)跨膜區(qū)域，N-端含有一個(gè)指環(huán)。而指環(huán)即是泛素傳遞活性的根本所在，早期研究認(rèn)為如果缺乏MITOL或指環(huán)突變將會(huì)導(dǎo)致線粒體的碎裂，但近年來更多的資料顯示缺乏MITOL的線粒體的形狀會(huì)變長(zhǎng)，引起細(xì)胞加速衰老，隨即引起線粒體呼吸鏈氧化磷酸化功能障礙［11］。本研究顯示，觀察組注射 3、7、14、21 d MITOL 表達(dá)較對(duì)照組及同組注射前升高，充分說明線粒體的形態(tài)和功能一直處于MITOL的動(dòng)態(tài)調(diào)控中。

綜上所述，PHN大鼠脊髓背角組織MITOL蛋白表達(dá)增加，而且與痛覺閾值的高低緊密相關(guān)，可能參與了PHN的產(chǎn)生和維護(hù)。

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