程星，曹麗萍，喬佑杰，王永明

（1天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070;2天津市人民醫(yī)院;3天津醫(yī)院）

膿毒癥是危重病患者常見死亡病因，而急性腎損傷是膿毒癥常見及嚴(yán)重的并發(fā)癥，膿毒癥合并急性腎損傷時病死率明顯增加［1］。研究［2］表明，膿毒癥并發(fā)急性腎損傷的病死率為74.5%，而不伴有急性腎損傷的病死率為45.2%。膿毒癥是嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是促炎反應(yīng)與抑炎反應(yīng)失衡的結(jié)果。巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）是一種重要的炎癥因子，參與膿毒癥多臟器功能不全綜合征（MODS）及急性腎損傷的發(fā)病過程。2013年6～12月，我們觀察了血必凈對膿毒癥急性腎損傷大鼠腎功能的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 大鼠MIF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒、TRIzol購自天津?yàn)笥邢薰?，?shí)時定量PCR儀購自杭州博日科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組 雄性SD大鼠80只，8～10周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心。按照隨機(jī)原則分為對照組16只、模型組32只、干預(yù)組32只。

1.3 模型制備及血必凈干預(yù) 動物購置后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前禁食過夜，自由飲水。模型組及干預(yù)組依照Chaudrv等報道的方法進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)復(fù)制膿毒癥動物模型。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后固定，常規(guī)消毒，鋪無菌洞巾，沿腹正中線作1.5 cm切口，找到盲腸，在盲腸根部進(jìn)行結(jié)扎，避免結(jié)扎回腸以及盲腸系膜血管，用16號穿刺針貫通穿刺盲腸2次，并留置一條橡皮片貫通盲腸，防止針孔閉合，最后將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。術(shù)畢立即在動物皮下注射生理鹽水5 mL，以補(bǔ)充術(shù)中體液丟失并防止休克，術(shù)后自由飲水。對照組麻醉固定后，常規(guī)消毒，鋪無菌洞巾沿腹部正中線作1.5 cm切口，打開腹腔，找到盲腸，翻動腸管，然后還納腹腔，其他與模型組、干預(yù)組操作一致。對照組及模型組于術(shù)后開始腹腔注射生理鹽水4 mL/kg，干預(yù)組于術(shù)后開始腹腔注射血必凈4 mL/kg，均為每12 h給藥1次，直至動物死亡或?qū)嶒?yàn)結(jié)束。

1.4 血清肌酐（Cr）、MIF及腎組織MIF mRNA檢測 實(shí)驗(yàn)動物分別在術(shù)后2、8、24、48 h處死（對照組每個時點(diǎn)處死4只，模型組及干預(yù)組每個時點(diǎn)處死8只），留取心臟血5 mL，靜置20 min，臺式離心機(jī)以3 000 r/min離心15 min，收集血清，-80℃冰箱保存，使用Beckman CoulterDxc800型自動生化分析儀測定血清Cr，采用ELISA法測定血清MIF。稱取腎組織100 mg作為組織標(biāo)本，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗，用液氮保存標(biāo)本，并制備腎組織勻漿，應(yīng)用實(shí)時定量PCR反應(yīng)檢測腎組織MIF mRNA。引物由上海生物工程有限公司合成。首先進(jìn)行腎組織總RNA的制備，然后制備cDNA模板，確定目的基因退火溫度，進(jìn)行實(shí)時定量 PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;94℃變性20 s，59℃退火20 s，40個循環(huán);57～96℃繪制熔解曲線。按RTQ-PCR說明書將各個標(biāo)本的實(shí)時定量PCR結(jié)果以經(jīng)β-actin校正后，應(yīng)用2-ΔΔCt計算后的比率值表示基因表達(dá)的相對變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。連續(xù)型數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布者以±s表示，組內(nèi)不同時間點(diǎn)比較及組間同一時間點(diǎn)比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，對檢測指標(biāo)做Pearson直線相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠術(shù)后不同時點(diǎn)血清Cr、MIF水平及腎組織MIF mRNA表達(dá)比較 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時點(diǎn)血清Cr、MIF水平及腎組織MIF mRNA 表達(dá)比較（ ± s）

表1 各組大鼠術(shù)后不同時點(diǎn)血清Cr、MIF水平及腎組織MIF mRNA 表達(dá)比較（ ± s）

注:與同組術(shù)后2 h比較，AP＜0.05;與同組術(shù)后8 h比較，BP＜0.05;與同組術(shù)后24 h比較，CP ＜0.05;與干預(yù)組比較，aP ＜0.05;與對照組比較，bP ＜0.05。

組別 Cr（μmol/L） MIF（μmol/L）MIF mRNA模型組2 h 32.50 ±2.45 12.89 ±1.25 1.55 ±0.54 8 h 34.13 ±2.36 14.94 ±1.87 2.56 ±1.19 24 h 44.50 ±4.90ABab 18.84 ±4.02ABab 3.97 ±1.67Aab 48 h 69.50 ±5.50ABCab21.90 ±2.97ABCab6.08 ±2.17ABCab干預(yù)組2 h 30.13 ±5.11 13.19 ±1.89 1.22 ±0.40 8 h 34.25 ±4.59 13.16 ±2.79 2.13 ±0.86A 24 h 39.50 ±5.93Ab 13.92 ±2.72 2.36 ±0.63A 48 h 44.87 ±8.48ABCb14.00 ±2.23 4.70 ±1.12ABC對照組2 h 31.00 ±1.83 12.24 ±0.91 1.08 ±0.04 8 h 29.50 ±1.29 12.15 ±1.71 1.34 ±0.79 24 h 31.75 ±2.22 11.75 ±0.85 1.87 ±0.72 48 h 32.75 ±1.71 12.83 ±1.45 2.98 ±0.78ABC

2.2 大鼠血清MIF、腎組織MIF mRNA與血清Cr水平的關(guān)系 血清MIF水平與血清Cr水平呈正相關(guān)（r=0.641，P＜0.05），腎組織 MIF mRNA 與血清Cr水平呈正相關(guān)（r=0.696，P＜0.05）。

3 討論

膿毒癥是胰腺炎、創(chuàng)傷、燒傷等臨床危重患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是誘發(fā)MODS的重要病因。膿毒癥的發(fā)病與感染、炎癥反應(yīng)、免疫功能紊亂、凝血功能障礙等因素密切相關(guān)，其中炎癥反應(yīng)是最主要環(huán)節(jié)。機(jī)體產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，形成炎癥瀑布效應(yīng)，造成MODS。多種因素可導(dǎo)致急性腎損傷，包括腎血流量的減少、腎臟毒性藥物的使用及近端小管的細(xì)胞損傷或細(xì)胞凋亡以及腎臟細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［3］，其中膿毒癥導(dǎo)致的急性腎損傷約占50%［4］。膿毒癥時，中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生復(fù)雜的免疫應(yīng)答反應(yīng)，釋放出大量炎癥介質(zhì)，從而造成腎臟損害。2005年9月在阿姆斯特丹舉行的急性腎衰竭國際研討會提出了急性腎損傷分期［5］，以血Cr水平為標(biāo)準(zhǔn)，分為3期，即1期為血清Cr升高＞0.3 mg/dL或增加 ＞50%，2期為 Cr升高 ＞200% ～300%，3期為 Cr增加 ＞300% 或 ＞4.0 mg/dL（急性升高 ＞0.5 mg/dL），表明 Cr水平可評價急性腎損傷嚴(yán)重程度。本研究顯示，模型組術(shù)后24、48 h血清Cr水平高于對照組，提示模型組大鼠已存在急性腎損傷。血必凈具有清除炎癥介質(zhì)的作用，有研究表明血必凈可通過抑制MIF的合成與釋放，降低MIF水平［6］，有效地防止腎組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展，進(jìn)而減輕急性腎損傷程度［7］。本研究顯示，干預(yù)組術(shù)后24、48 h Cr水平低于模型組，提示術(shù)后經(jīng)血必凈干預(yù)后，膿毒癥急性腎損傷大鼠腎功能得到改善。

多項(xiàng)研究表明，MIF是一種晚期促炎因子，參與膿毒癥MODS的發(fā)病過程［8］，且與膿毒癥的嚴(yán)重程度及預(yù)后有關(guān)，并可預(yù)測患者死亡及預(yù)后［9，10］。敲除了MIF基因的小鼠對炎癥的免疫應(yīng)答則明顯減弱［11］，使用抗 MIF因子可明顯降低膿毒癥大鼠MODS 的發(fā)生率及病死率［12］。張振輝等［13］研究表明，MIF作為晚期炎性介質(zhì)參與膿毒癥急性腎損傷的發(fā)病過程。Payen［5］研究也表明，膿毒癥患者中，MIF水平隨著腎損傷嚴(yán)重程度的加重而升高。本研究顯示，模型組術(shù)后24、48 h血清MIF水平及腎組織MIF mRNA高于對照組，而干預(yù)組術(shù)后24、48 h血清MIF水平及腎組織MIF mRNA低于模型組，且血清MIF水平、腎組織MIF mRNA均與血清Cr水平呈正相關(guān)，提示急性腎損傷嚴(yán)重程度與血清MIF、腎組織MIF mRNA水平有密切關(guān)系，血必凈可能是通過降低血清MIF及腎組織MIF mRNA而達(dá)到改善膿毒癥急性腎損傷大鼠腎功能的作用。

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