陸　琤　周晨辰　張鵬飛　張　硌*

原核質(zhì)粒pGEX-4T-2-PLEKHQ1及真核質(zhì)粒pCMV-Myc-PLEKHQ1的構(gòu)建與蛋白表達*

陸琤①周晨辰①張鵬飛①張硌①*

陸琤,女,(1987- ),碩士，助理工程師。軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院醫(yī)學工程科，從事細胞信號轉(zhuǎn)導研究工作。

目的：構(gòu)建基因PLEKHQ1的原核質(zhì)粒及真核質(zhì)粒。方法：全長編碼基因PLEKHQ1的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和Kpn1雙酶切后，分別與雙酶切后的載體pGEX-4T-2及載體pCMV-Myc相連，在pGEX-4T-2-PLEKHQ1轉(zhuǎn)化E.coli DH5α提取質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化E.coli BL21中誘導GST-Q1融合蛋白表達，利用谷胱甘肽瓊脂糖4B純化誘導的融合蛋白；而pCMVMyc-PLEKHQ1則瞬轉(zhuǎn)至293TX細胞；用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測GST-Q1和Myc-Q1融合蛋白表達。結(jié)果：將獲得的重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，得到約1500 bp的目的片段，符合預(yù)計大小。質(zhì)粒經(jīng)測序分析正確后，Western blot檢測到誘導及純化后的GST-Q1和轉(zhuǎn)染293TX后的Myc-Q1蛋白。結(jié)論：成功構(gòu)建的pGEX-4T-2-PLEKHQ1和pCMV-Myc-PLEKHQ1重組質(zhì)粒，為深入研究PLEKHQ1功能奠定良好的基礎(chǔ)。

基因PLEKHQ1；pGEX-4T-2載體；pCMV-Myc載體；重組質(zhì)粒；表達

DOI∶ 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2015.05.002

[First-author’s address] Department of Medical Engineering, No.307 Hospital of PLA, Beijing 100071, China.

基因PLEKHQ1(pleckstrin homology domain containing，family Q member 1)又被稱為基因PLEKHO2(pleckstrin homology domain containing，family O member 2)，是一種包含490個氨基酸的蛋白質(zhì)，被證實包含至少一個PH結(jié)構(gòu)域(Pleckstrin Homolgy Domain)，PH結(jié)構(gòu)域負責形成蛋白-蛋白和蛋白-脂質(zhì)之間的相互作用。在人體內(nèi)，編碼PLEKHQ1的基因存在于15號染色體上[1-7]。PLEKHQ1與CKIP-1同屬于含有PH結(jié)構(gòu)域的蛋白超家族，目前為止還無任何文獻專門對其功能進行報道。本研究通過生物信息學分析顯示，基因PLEKHQ1的PH結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合磷脂(phospholipid，PI)，從而可能參與細胞因子與受體的相互作用。前期研究表明，PLEKHQ1基因可能在巨噬細胞功能調(diào)控中發(fā)揮作用，因此深入研究PLEKHQ1的特性可能具有重要意義。為此，本研究旨在利用基因重組技術(shù)構(gòu)建PLEKHQ1的原核質(zhì)粒和真核質(zhì)粒，并鑒定其在大腸桿菌及哺乳動物細胞中的表達，為進一步研究PLEKHQ1的生物學功能奠定一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

原核質(zhì)粒pGEX-4T-2、真核質(zhì)粒pCMV-Myc均為本實驗室保存；感受態(tài)細菌DH5α、BL21、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA電泳凝膠回收試劑盒均購自天根科技生化(北京)有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、Kpn1、Q5 high-fidelity DNA polymerase、dNTPs以及DNA marker均購自NEB公司；DNA Ligation Kit購自大連TaKaRa公司；PCR引物合成由北京天一輝遠生物科技有限公司完成；脂質(zhì)體lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；異丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)為amresco公司產(chǎn)品；谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)、PLEKHQ1抗體購自santa cruz公司，Myc抗體購自MBL公司；抗鼠IgG-HRP購自Jackson免疫公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Protein marker以及ECL發(fā)光試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；Glutathione Sepharose 4B購自GE healthcare；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2PLEKHQ1基因片段的獲取及其原核質(zhì)粒、真核質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1PLEKHQ1基因片段的獲取

本研究以人胚腎上皮細胞293T的cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列為：①正向引物-CTTCGA ATTCATATGGAGGAGGAGGGTGTGAAGG，含EcoR1酶切位點；②反向引物-GCAGGTACCCTAG GGTGCACTTCTCCTGTAGA，含Kpn1酶切位點。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)反應(yīng)條件為：98 ℃，10 s；66 ℃，30 s；72 ℃，120 s；共34個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.2PLEKHQ1原核質(zhì)粒及真核質(zhì)粒的構(gòu)建

分別用EcoRⅠ和Kpn1雙酶切pGEX-4T-2、pCMV-Myc和PLEKHQ1 PCR產(chǎn)物，當1%瓊脂糖凝膠電泳顯示酶切結(jié)果正確后，凝膠回收載體片段和目的片段。分別將pGEX-4T-2與PLEKHQ1、pCMVMyc與PLEKHQ1用DNA連接試劑盒在溫度為16 ℃連接30 min，得到連接產(chǎn)物。分別將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化至100 ul感受態(tài)細菌DH5α，涂布在含氨芐青霉素的LB瓊脂平板中，置于37 ℃恒溫箱(倒置)培養(yǎng)過夜。各挑取2個陽性菌落，擴增后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用EcoR1和Kpn1雙酶切鑒定，并將重組質(zhì)粒送公司進行測序分析，經(jīng)測序正確后將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pGEX-4T-2-PLEKHQ1和pCMV-Myc-PLEKHQ1。

1.3重組原核質(zhì)粒的誘導表達、GST融合蛋白的純化及重組真核質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)293TX細胞

1.3.1重組原核質(zhì)粒的誘導表達及GST融合蛋白的純化

(1)上樣液A的制作。將測序正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-PLEKHQ1和pGEX-4T-2載體分別轉(zhuǎn)化BL21，涂布于含氨芐霉素的LB瓊脂平板，置于37 ℃恒溫箱(倒置)培養(yǎng)過夜。挑取轉(zhuǎn)化后的單克隆接種于3 ml含氨芐霉素LB培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜后將菌液按1∶100接種到5 ml氨芐LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至OD 600為0.5～1.0，取0.5 ml菌液作為未誘導表達的對照，其余菌液加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，30 ℃、250 rpmin誘導表達約5 h，收集細菌，加入450 ul的TNE裂解液[50 mmol/L Tris，pH值為7.4；150 mmol/L NaCl；1%的NP-40；1 mmol/L乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)；10%的丙三醇]超聲至澄清，取未誘導菌液和誘導菌液各30 ul制成上樣液A，進行Western blot檢測誘導結(jié)果。

(2)上樣液B的制作。誘導成功后進行GST融合蛋白的純化。谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B(Glutathione Sepharose 4B)用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗3次，每次10 min。將含有GST融合蛋白的上清加入Glutathione Sepharose 4B，常溫4 ℃下旋轉(zhuǎn)孵育過夜；2000 r/min，離心5 min，收集Glutathione Sepharose 4B；使用TNE裂解液洗Glutathione Sepharose 4B3次，每次10 min。取20 ul Glutathione Sepharose 4B制成上樣液B，進行免疫印跡(Western blot)檢測純化結(jié)果。

1.3.2重組真核質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)293TX細胞

上樣液C的制作。取處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的293TX細胞鋪于12孔板中，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、溫度為37 ℃、5%的CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞融合至約80%時，用人工脂質(zhì)體法將空載體、pCMV-Myc-PLEKHQ1分別瞬轉(zhuǎn)到細胞中，每孔1.5 μg，培養(yǎng)24 h后收集細胞；使用RIPA裂解液(50 mmol/L Tris，pH值為7.4；150 mmol/L NaCl；1%的NP-40；1 mmol/L EDTA；10%的丙三醇；0.5%SDS)裂解后制成上樣液C。

1.4Western blot檢測

將上樣液A、上樣液B及上樣液C用12%的SDSPAGE凝膠分離；90 mA，3 h電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜；用5%脫脂奶，水平脫色搖床室溫震蕩封閉1 h；與1∶1000稀釋后的GST、PLEKHQ1及Myc一抗于4 ℃孵育過夜；用洗液TBST漂洗3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG二抗，水平脫色搖床室溫孵育1 h；用洗液TBST漂洗3次，每次10 min；用增強化學發(fā)光(enhanced chemi luminescence，ECL)試劑盒顯影并觀察結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1獲取目的片段PLEKHQ1的PCR產(chǎn)物

以cDNA作為模板，用PCR方法擴增目的片段。共設(shè)為3組，其中設(shè)1組、3組為陰性對照。1組加入dNTP、引物及酶，不加模板；3組加入dNTP、引物及模板，不加酶；2組作為實驗組，加入dNTP、引物、模板及酶；反應(yīng)結(jié)束后置于1%瓊脂糖凝膠中電泳，在2組中出現(xiàn)約1500 kb亮帶，與預(yù)期結(jié)果相符(如圖1所示)。

圖1　PLEKHQ1的PCR產(chǎn)物DNA電泳分析圖

2.2PLEKHQ1重組原核表達質(zhì)粒及重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

重組原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-2-PLEKHQ1(1#、2#)經(jīng)EcoRⅠ、Kpn1雙酶切后，1組得到約4900 bp和1500 bp左右的兩條帶(如圖2(a)所示)，pCMV-Myc-PLEKHQ1(1組、2組)經(jīng)EcoRⅠ、Kpn1雙酶切后均得到約3800 bp和1500 bp左右的兩條帶(如圖2(b)所示)，與PLEKHQ1的cDNA及pGEX-4T-2、pCMV-Myc的長度相符，并經(jīng)測序鑒定正確。

圖2　重組質(zhì)粒的酶切電泳分析圖

2.3原核重組質(zhì)粒在BL21中的誘導表達及純化

融合表達質(zhì)粒pGEX-4T-2-PLEKHQ1(1#)經(jīng) IPTG誘導后在BL21中大量表達，經(jīng)過Western blot顯片在大約100 kDa處出現(xiàn)一條明顯的特異性蛋白條帶(如圖3(a)所示)，利用GST-beads對誘導表達的GST及GST-Q1融合蛋白進行純化后，經(jīng)過Western blot顯片(如圖3(b)所示)。

圖3　SDS-PAGE電泳分析GST和GST-PLEKHQ1在BL21中誘導純化示圖

2.4真核重組質(zhì)粒的蛋白表達

使用anti-Myc單克隆抗體進行Western blot顯示，1列為轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照，未出現(xiàn)條帶，2列為轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-PLEKHQ1的實驗組，出現(xiàn)了相對分子質(zhì)量約為80 kDa的特異性反應(yīng)條帶，同預(yù)期的結(jié)果一致，表明所構(gòu)建的真核質(zhì)粒已在真核細胞293TX內(nèi)表達(如圖4所示)。

圖4　pCMV-Myc-PLEKHQ1重組質(zhì)粒在293TX細胞中的蛋白表達電泳圖

3　討論

由于基因PLEKHQ1與CKIP-1屬于同一家族，都包含PH結(jié)構(gòu)域，而CKIP-1又稱PLEKHO1，具有許多參與蛋白-蛋白相互作用、蛋白-脂質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域或模體，且有許多潛在的磷酸化位點，具有非常重要的生物學功能，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有可能起著重要作用[8-10]。因此本研究在對CKIP-1的實驗過程中，關(guān)注了PLEKHQ1基因。

本研究中采用pGEX-4T-2原核質(zhì)粒，此類載體含有高效的原核表達啟動子，能夠在感受態(tài)細菌體內(nèi)高效表達重組蛋白。本實驗成功構(gòu)建了pGEX-4T-2-PLEKHQ1表達質(zhì)粒，并建立GST-PLEKHQ1體外純化表達系統(tǒng)，利用體外純化蛋白可進行生物學實驗研究，例如GST pull-down驗證蛋白相互作用。同時，也為能在真核細胞中表達PLEKHQ1蛋白，用于在體或離體的實驗研究。采用pCMV-Myc真核質(zhì)粒，其含有CMV啟動子可以高效啟動目的蛋白在細胞中的表達。構(gòu)建的pCMV-Myc-PLEKHQ1通過酶切、測序、轉(zhuǎn)染并經(jīng)Western blot證實融合蛋白的正確性，為深入探討PLEKHQ1的生物學功能提供了可靠的研究手段和實驗依據(jù)。

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Construction of pGEX-4T-2-PLEKHQ1 prokaryotic plasmid and pCMV-Myc-PLEKHQ1 eukaryotic plasmid and their protein expression

LU Cheng, ZHOU Chen-chen, ZHANG Peng-fei, et al

China Medical Equipment,2015,12(5)∶5-8.

Objective∶ To construct prokaryotic plasmid and eukaryotic plasmid of PLEKHQ1 gene. Methods∶ The PCR product of the PLEKHQ1 coding sequence, which was digested with EcoR1 and Kpn1 restriction enzymes, was taped into the plasmid pGEX-4T-2 and pCMVMyc. Then pGEX-4T-2-PLEKHQ1 was transformed into E.coli DH5α and plasmid DNA was extracted. After that, the expression of GST-Q1 fusion protein was induced in BL21 and was purified by Glutathione Sepharose 4B. While the pCMV-Myc-PLEKHQ1 was transfected into TX cells. The expression of both GST-Q1 and Myc-Q1 was detected by Western blot. Results∶ The restriction enzyme digestion showed target fragment of 1500bp, which was as expected. The recombinant plasmid was sequenced right and GST-Q1 protein and Myc-Q1 protein could be detected by Western blot. Conclusion∶ The recombinant prokaryotic plasmid and eukaryotic expression plasmid were successfully constructed, which laid a foundation for further research for PLEKHQ1.

PLEKHQ1; pGEX-4T-2 vector; pCMV-Myc vector; Recombinant plasmid; Expression

1672-8270(2015)05-0005-04

R392.1

A

國家自然科學基金(31400739)“PH結(jié)構(gòu)域蛋白PLEKHQ1協(xié)調(diào)巨噬細胞遷移與激活的機制研究”北京市自然科學基金(5144033)“PH結(jié)構(gòu)域蛋白PLEKHQ1調(diào)控巨噬細胞激活及遷移的機制研究”

①軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院醫(yī)學工程科 北京 100071

marbleluo@126.com

2014-12-10