梁海恬+何宗均+高賢彪+吳迪+李妍+李峰+趙琳娜+錢(qián)姍+王德芳+田陽(yáng)

摘 ? ?要：采用常規(guī)分離方法對(duì)采集樣品進(jìn)行微生物分離，通過(guò)分析分離菌株對(duì)高嶺土懸液的絮凝效果，篩選出4株具有高生物絮凝活性的菌株，其中菌株X1801的絮凝率可達(dá)98.56%。采用形態(tài)學(xué)特征、生理生化方法和16S rDNA基因序列比對(duì)方法對(duì)該菌株進(jìn)行分析，鑒定該菌株為簡(jiǎn)單芽孢桿菌（Bacillus simplex），菌株應(yīng)用于污水處理表現(xiàn)出較強(qiáng)絮凝活性。

關(guān)鍵詞：農(nóng)村污水;絮凝菌株;16S rDNA;絮凝特性

中圖分類(lèi)號(hào)：S224.21 ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.12.006

Screening and Identification of Bio-flocculate Producing Strain for Rural Wastewater Treatment

LIANG Hai-tian， HE Zong-jun， GAO Xian-biao， WU Di， LI Yan， LI Feng， ZHAO Lin-na， QIAN Shan， WANG De-fang， TIAN Yang

（Tianjin Institute of Agricultural Resource and Environmental Science， Tianjin 300192，China）

Abstract： This study focus on the bacterial screened from different samples by means of common bacteria screening and purification method. Based on the effect of kaolin suspending liquid test， 4 strains were obtained. The flocculating rate of strain X1801 reached 98.56%. According to morphological characteristics， physiochemical test and 16S rDNA gene sequence analysis， strain X1801 was identified as Bacillus simplex， and it showed significant flocculation effect on the wastewater treatment.

Key words： rural wastewater;bio-flocculation strain;16S rDNA; flocculation characteristic

目前，我國(guó)城鎮(zhèn)地區(qū)污水基本納入下水管網(wǎng)，輸送至大型污水處理廠進(jìn)行集中處理，水處理的技術(shù)能力已達(dá)到一定水平，絮凝技術(shù)常作為重要的基本操作單元被廣泛應(yīng)用[1-3]。農(nóng)村經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的同時(shí)，污水排放量也日益增加，由于這類(lèi)污水經(jīng)過(guò)處理后多排放至河流、湖泊等受納水體中，因此，農(nóng)村污水處理工藝的安全性是關(guān)系農(nóng)村生態(tài)環(huán)境和食品安全的重要問(wèn)題。生活污水處理主要分為好氧生物處理、厭氧生物處理和自然生物處理，在實(shí)際中為了提高處理效率，達(dá)到排放要求，常采用多種處理技術(shù)復(fù)合應(yīng)用[4-5]，絮凝沉降法由于具有成本低、工藝簡(jiǎn)單、效果穩(wěn)定等特點(diǎn)，在污水一級(jí)處理工藝中占有重要地位[6-9]。

由于無(wú)機(jī)絮凝劑和有機(jī)高分子絮凝劑在使用安全性方面存在一定問(wèn)題，因此易降解、無(wú)二次污染的生物絮凝劑在污水處理工藝上的研究越來(lái)越受到關(guān)注[10-11]。生物絮凝劑是一類(lèi)由微生物代謝產(chǎn)生的具有絮凝功能的高分子物質(zhì)，對(duì)水體中的懸浮物、金屬離子等具有一定的吸附作用。已有研究表明，微生物絮凝劑可以有效地應(yīng)用于生活廢水和工業(yè)污水的處理。例如蘇曉梅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，生物絮凝劑MAC37在黏合劑廢水處理中具有較好的應(yīng)用效果。Li O等[13]的研究表明，Paenibacillus etgii B69菌株產(chǎn)生的絮凝劑不僅對(duì)市政污水具有很好的絮凝澄清作用，對(duì)于染料廢水、重金屬污染也具有良好的去除作用，具有絮凝功能的微生物涵蓋多種群，涉及細(xì)菌、真菌、放線菌等，其應(yīng)用領(lǐng)域也日益廣泛[14-16]。本研究從多種類(lèi)型的采集樣品中篩選出一株具有高絮凝活性的微生物菌株，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定和絮凝特性研究，為該菌株在水處理領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種來(lái)源：試驗(yàn)菌株篩選自污水處理廠、菜園土等地的采集樣品，經(jīng)微生物富集、分離、培養(yǎng)、純化及傳代穩(wěn)定性檢驗(yàn)后得到菌株的純培養(yǎng)物，實(shí)驗(yàn)室低溫保藏。

分離培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，K2HPO45 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，脲0.5 g，KH2PO4 2 g，NaCl 0.1 g，酵母膏0.5 g，蒸餾水1 000 mL， pH值7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，（NH4）2SO4 2 g，KCl 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水1 000 mL， pH值7.5。

所用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，市售。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的篩選 絮凝菌株的初篩方法：采用平板梯度稀釋法對(duì)新鮮樣品進(jìn)行分離，將梯度稀釋后的菌液均勻涂布于分離培養(yǎng)基上進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行平板劃線，以獲得純培養(yǎng)物。采用高嶺土絮凝法對(duì)菌株進(jìn)行絮凝效果初篩，觀察各菌株是否具有形成絮狀沉淀的特性。

絮凝菌株的復(fù)篩方法：對(duì)具有絮凝能力的分離菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)獲得48 h發(fā)酵液，采用高嶺土絮凝法進(jìn)行絮凝效果測(cè)定，以高嶺土懸濁液為空白對(duì)照，各處理靜置10 min后，使用721型分光光度計(jì)測(cè)定上清液在550 nm處的OD值。選取絮凝效果好的菌株進(jìn)行傳代穩(wěn)定性檢驗(yàn)，低溫保藏。

絮凝率的計(jì)算公式如下：

μ=[（A1-B1）/A1]×100%

其中，A1表示空白對(duì)照在550 nm處的吸光度OD550，A1表示菌發(fā)酵液在550 nm處的吸光度OD550，μ表示加入絮凝發(fā)酵液后水中懸浮物的去除率。

1.2.2 菌株的鑒定 （1）形態(tài)學(xué)觀察。將純培養(yǎng)物接種于三角瓶中，28 ℃培養(yǎng)24 h，涂布于平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)，采用革蘭氏染色法進(jìn)行菌體形態(tài)觀察。

（2）生理生化測(cè)定。試驗(yàn)方法參照《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行 [17-18]，主要包括染色試驗(yàn)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、糖發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)等。

（3）菌株。16S rDNA基因序列分析 采用TIANGEN試劑盒DP209對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行基因組DNA提取，操作步驟依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

提取基因組DNA后，對(duì)16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物為通用引物，正向引物PF 5-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3和反向引物PR 5 -AAG GAG GTG ATC CAR CCG CA-3。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL：Premix 20 μL，引物各1 μL，模板DNA 2 μL，超純水26 μL。PCR程序：95 ℃ 7 min;35循環(huán)（95 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s）;72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物分析后，TIANGEN膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收并測(cè)序。

將測(cè)序結(jié)果16S rDNA序列發(fā)送到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST搜索，選取相似度高的序列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌種分類(lèi)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)所用軟件為MEGA5.05和Custal X。

1.2.3 絮凝菌對(duì)污水懸浮物指標(biāo)（SS）的去除效果研究 取1環(huán)生長(zhǎng)良好的絮凝菌株斜面培養(yǎng)物至裝有250 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28～30 ℃搖床150 r·min-1培養(yǎng)48 h，離心后獲得上清生物絮凝劑。

采集污水樣品，置于實(shí)驗(yàn)室小型絮凝反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值至8.0，將生物絮凝劑按1%，3%，5%，7%，9%的比例加入反應(yīng)器中，攪拌均勻后靜置30 min測(cè)定反應(yīng)器水樣中的懸浮物指標(biāo)（SS）。懸浮物指標(biāo)（SS）的測(cè)定方法參考GB 11901-1989水質(zhì)懸浮物的測(cè)定重量法。

2 結(jié)果與分析

2.1 絮凝高效菌株的篩選

對(duì)采集樣品中的絮凝微生物進(jìn)行初篩后，獲得4株具有較高絮凝活性的菌株，采用高嶺土絮凝法進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果表明（表1），絮凝效果較好的菌株Z2701、Z1902、X1801和X1806絮凝率分別為94.23%，96.54%，97.88%，98.56%，其中菌株X1801形成的絮狀顆粒較大，絮凝沉降速率較快，穩(wěn)定性好，本研究選取絮凝效果最好的菌株X1801進(jìn)行菌株鑒定和絮凝特性研究。

2.2 菌株形態(tài)及生理生化試驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，通過(guò)對(duì)分離得到的純培養(yǎng)物進(jìn)行平板涂布，觀察到該菌株生長(zhǎng)旺盛，好氧型。菌落形態(tài)為乳白色半透明狀圓形菌落，表面突起，菌落邊緣較為整齊，用接種環(huán)挑取菌落時(shí)感覺(jué)質(zhì)地粘稠。

表2顯示的是菌株的部分生理生化試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體呈革蘭氏陽(yáng)性（G+），桿狀細(xì)胞，有芽孢形成，菌體大小為0.3～1 μm×2.0 ～3 μ m，呈單個(gè)或V字型排列。菌株的部分生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，該菌株為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，細(xì)胞形狀為桿狀，細(xì)胞直徑<1 μm，有芽孢，接觸酶、淀粉水解、水解明膠均為陽(yáng)性，厭氧生長(zhǎng)陰性，甲基紅試驗(yàn)陰性，β-半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶、賴(lài)氨酸脫羧酶陰性， pH值5.7生長(zhǎng)。

根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步判斷該菌株的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征與芽孢桿菌屬相近。

2.3 菌株16S rDNA基因序列分析

圖2顯示的是對(duì)絮凝菌株的目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)，所用Marker為DL5000，獲得大小約為1 400 bp左右的產(chǎn)物條帶。對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行產(chǎn)物回收，測(cè)序結(jié)果顯示該菌株的16S rDNA核苷酸序列長(zhǎng)度為1 427 bp，將該序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST搜索，獲得13條相似度較高的模式菌株16S rDNA序列。采用鄰接法進(jìn)行聚類(lèi)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示。

試驗(yàn)結(jié)果表明，絮凝菌株X1801在發(fā)育樹(shù)中位于芽孢桿菌屬（Bacillus）分支中，系統(tǒng)分類(lèi)支持率較高。并且與標(biāo)準(zhǔn)模式菌株Bacillus simplex的同源性高達(dá)92%，提示該絮凝菌株可能與菌株Bacillus simplex相似度較高，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征及生理生化特征，該菌株鑒定為簡(jiǎn)單芽孢桿菌（Bacillus simplex）。

2.4 對(duì)污水懸浮物指標(biāo)（SS）的去除效果

使用實(shí)驗(yàn)室小型絮凝反應(yīng)器對(duì)菌株X1801的生物絮凝效果進(jìn)行研究，采集污水的初始懸浮物SS平均濃度為70.39 mg·L-1，分別按比例加入1%，3%，5%，7%，9%生物絮凝劑后，攪拌均勻后靜置30 min取樣進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，絮凝率分別為56.61%，62.54%，68.13%，69.23%和71.37%，處理后污水的懸浮物指標(biāo)SS基本達(dá)到國(guó)家二級(jí)排放標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論與討論

（1）本研究從多種類(lèi)型的采集樣品中篩選到1株具有較高絮凝活性的微生物菌株X1801，對(duì)其絮凝特性進(jìn)行了初步的研究，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征和生理生化試驗(yàn)，結(jié)合菌株16S rDNA基因序列分析，鑒定該菌株為簡(jiǎn)單芽孢桿菌（Bacillus simplex）。絮凝菌株X1801在實(shí)驗(yàn)室小型絮凝反應(yīng)器中應(yīng)用試驗(yàn)表明，對(duì)污水SS具有較好的絮凝效果，處理后水中懸浮物指標(biāo)基本達(dá)到國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)，具有一定的應(yīng)用前景。

（2）由于農(nóng)村地區(qū)的污水排放具有分散，產(chǎn)量低等特點(diǎn)，收集處理的難度較大，現(xiàn)有農(nóng)村污水幾乎50%以上未經(jīng)處理，直接排放至自然水體和土壤中，或直接進(jìn)行農(nóng)田回用。農(nóng)村是種植、養(yǎng)殖業(yè)聚集地，具有食品生產(chǎn)轉(zhuǎn)化功能，因此，農(nóng)村地區(qū)的水安全問(wèn)題更關(guān)乎食品安全問(wèn)題，出水的安全性要求應(yīng)更加嚴(yán)格。傳統(tǒng)的無(wú)機(jī)絮凝劑和有機(jī)高分子絮凝劑所呈現(xiàn)的弊端更加明顯，對(duì)水處理劑的安全性要求更高，因此，亟需開(kāi)發(fā)適合農(nóng)村污水處理的生物絮凝劑。本研究對(duì)象生物絮凝菌株X1801具有較高的絮凝活性，有利于開(kāi)發(fā)出一種穩(wěn)定的生物絮凝劑，用于農(nóng)村污水處理。

（3）國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于生物絮凝菌株研究的報(bào)道，但將簡(jiǎn)單芽孢桿菌應(yīng)用農(nóng)村污水處理生物絮凝工藝上的報(bào)道較少[19]，具有較好的應(yīng)用轉(zhuǎn)化前景。但由于微生物絮凝劑受到生產(chǎn)成本高、環(huán)境穩(wěn)定性差等特點(diǎn)的制約，在實(shí)際應(yīng)用中一直存在一定的瓶頸，因此，今后的研究應(yīng)關(guān)注生物絮凝劑工業(yè)化生產(chǎn)工藝的研究。

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