張海平+程小愛

摘 ? ?要：對水澇脅迫下歐李丙二醛和氧自由基含量變化進行初步研究，以期獲得歐李植物在成都地區(qū)的生長情況，為探討歐李植物的抗逆性提供理論基礎。以雙組份分光度法測定丙二醛的含量，提取液與TBA在沸水浴中反應后，分別測定450，532和600 nm波長下的吸光度值;利用O-2.與羥胺反應生成NO2-，NO2-在對氨基苯磺酸和a-萘胺作用下，生成粉紅色的偶氮染料，檢測植物葉片中O-2.含量。結果顯示，水澇脅迫下歐李生長期中，丙二醛含量呈上升趨勢;水澇脅迫下歐李氧自由基含量也增加。研究認為隨水澇脅迫程度的增加，歐李內(nèi)氧自由基含量增加，氧化脂膜，導致丙二醛含量增加。

關鍵詞：歐李;丙二醛;膜脂過氧化;氧自由基;水澇

中圖分類號：S793.9 ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.12.004

Changes of Malondialdehyde and Oxygen Free Radicals in Prunus humilis Bunge Leaves under Waterlogging Stess

ZHANG Hai-ping1， CHENG Xiao-ai2

（1. Dingxiang County State Forest， Shanxi Province， Dingxiang， Shanxi 035400， China; 2. Taigu County Agricultural Commission， Shanxi Province， Taigu， Shanxi 030800， China）

Abstract： MDA and oxygen free radicals were determined to obtain the growing state of Prunus humilis Bunge under waterlogging stress and provide theoretical basis for stress tolerance of Prunus humilis Bunge in Chengdu. The content of MDA was detected by two-component spectrophotometry method. The absorbance at 450， 532 and 600 nm were determined after the extract and TBA reacted in the boiling water bath; the content of O2-. was detected through pink azo dyestuffs which were obtained by the reaction of O2-. and hydroxylamine to gain NO2-， NO2- then reacted with sulfanilic acid and a-naphthalene amine. The results showed that the content of MDA and O2-. were all increased during the waterloggin. The contents of oxygen free radicals increased and caused bilayer lipid membrane oxidation; the contents of MDA also increased during the waterlogging because MDA was the product of bilayer lipid membrane oxidation.

Key words： Prunus humilis Bunge; malondialdehyde; membrane lipid peroxidation; oxygen free radicals; waterlogging

歐李[1]（又稱鈣果）Prunus humilis Bunge為薔薇科櫻桃屬矮生櫻桃亞屬的一種野生灌木果樹，主要分布在中西部的山西、河北、陜西、內(nèi)蒙等干旱地區(qū)。植株高0.3～1.5 m，抗寒，耐旱，適應性強。經(jīng)濟價值極高，用途非常廣泛?？墒秤?，仁可入藥，莖可作飼料。果實呈紅色，呈扁圓形、棗圓形、尖樁形不等，酸甜適中，味道可口，富含維生素A、維生素B2、維生素B12、維生素C、維生素E，微量元素氮、鉀、鈣、鐵、錳、鎂、鋅、硒等，而且含有多種氨基酸，果實含糖量可達13%～19%。在環(huán)境設計、水土流失防治等方面作用較好，被列為生態(tài)林優(yōu)良樹種。

隨著植物葉片的衰老[2]，植物中各項生理指標會有變化，如核酸和蛋白質(zhì)含量減少[3]、光合作用降低、葉綠素降解以及激素平衡失調(diào)等。這些指標可以反映植物衰老過程的變化。

自由基從產(chǎn)生到衰亡的過程就是電子轉(zhuǎn)移的過程[4]。在生命體系中，電子的轉(zhuǎn)移是一種基本的運動，生物體內(nèi)的氧最容易得到電子形成活性自由基。

代謝的氧大多數(shù)與氫結合生成水，4%～5%形成超氧陰離子，后者又可形成過氧化氫，它們都屬于自由基[5]。自由基有多種，如氧自由基，是指那些最外層電子軌道[6]原子、離子或分子。自由基具有高度的氧化活性，它們很不穩(wěn)定，活性很高，它攻擊細胞膜等膜類，與膜中的不飽和脂肪酸[7]反應，造成脂質(zhì)過氧化增強。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物又可分解為更多的自由基，引起自由基的連鎖反應。這樣，膜結構的完整性就遭到了破壞。目前發(fā)現(xiàn)的氧自由基基本上對植物是起負作用的。

通過呼吸作用進入生物體內(nèi)的氧分子，參與酶促或非酶促反應[8]時，只接受一個電子后轉(zhuǎn)變?yōu)槌蹶庪x子自由基（O-2.），O-2.既能與體內(nèi)的蛋白質(zhì)和核苷酸等活性物質(zhì)直接作用，又能衍生為H2O2，羥自由基（.OH），單線態(tài)氧（1O2）等。.OH可以引發(fā)不飽和脂肪酸脂質(zhì)（RH）過氧化反應。產(chǎn)生一系列自由基，例如：脂質(zhì)自由基（.R）、脂氧自由基（O-2.）、脂過氧自由基（ROO.）等?；鶊F旁邊的小圓點為不成對價電子，這種基團稱為自由基，帶有—O—O—的是過氧化物，1O2d的電子處于激發(fā)狀態(tài)。這些含有氧而比O2活潑得多的化合物，稱為活性氧，部分人將它們統(tǒng)統(tǒng)歸納為氧自由基類。一切需氧生物均能產(chǎn)生活性氧，在其體內(nèi)有一套完整的活性氧清除系統(tǒng)（抗氧化酶和抗氧化劑[9-10]），能將活性氧轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚暂^低的物質(zhì)，基體因此受到保護。利用羥胺氧化[11]的方法可以檢測出生物系統(tǒng)中O-2.含量。

自由基清除能力則隨年齡的增加而減少，有時甚至不能消除O-2.。O-2.反應能力很強，可使細胞中的多種物質(zhì)發(fā)生氧化，活性氧大量積累會引發(fā)或加劇細胞膜脂過氧化作用產(chǎn)生MDA[12]。MDA產(chǎn)生則進一步加劇細胞膜的損傷，并造成細胞膜系統(tǒng)的損害。所以，丙二醛產(chǎn)生數(shù)量從一定程度上代表細胞膜脂過氧化的程度，也可以間接反映植物組織的抗氧化能力的強弱。

1 材料和方法

1.1 試驗材料和儀器

1.1.1 植物材料 試驗材料為2008年從山西引種到成都的歐李。3月份移栽至花盆中，正常管理。設計為8株長勢相同的歐李，分為2組：處理組和對照組，處理組用水澇脅迫處理，對照組為正常條件下進行連續(xù)168 h的觀測。

1.1.2 藥品與試劑 試驗藥品：三氯乙酸、硫代巴比妥酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、石英砂;試劑：亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、a-萘胺、鹽酸羥胺及緩沖液，所用試劑都是分析純。

0.05 mol·L-1 pH 值7.8磷酸鈉緩沖液：先各配制0.05 mol·L-1的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，將兩者體積按照91.5∶8.5混合，得到目標溶液。

5%三氯乙酸溶液：稱5 g三氯乙酸固體，先溶解再定容至100 mL。

0.5%硫代巴比妥酸溶液：稱取0.5 g硫代巴比妥酸，用5%三氯乙酸溶解，定容至100 mL，得到目標溶液。

1.1.3 試驗儀器 CT15RT型高速冷凍離心機，上海天美生化儀器設備工程有限公司;7200 型可見光分光光度儀，尤尼柯（上海）儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司;FA2004B型電子天平，上海越平科學儀器有限公司;冰箱， 海爾;電熱鼓風干燥箱（DB-210SCB/3kW），成都天宇實驗設備有限公司;研缽;剪刀; 5 mL刻度離心管;刻度試管（10 mL）;鑷子; 移液管（5，2，1 mL）。

1.2 試驗方法

1.2.1 丙二醛含量的測量 （1） 丙二醛的提取。分別取歐李當年生枝條葉片，洗凈擦干，剪碎，分別稱取0.2 g左右于預冷過的研缽中，同時加入少量石英砂，2 mL預冷的0.05 mol·L-1 pH值7.8的磷酸緩沖液，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到5 mL刻度離心試管，用3 mL緩沖液分3次洗凈研缽，清洗液合并到離心管中，于8 000轉(zhuǎn)·min-1，4 ℃下離心15 min，取上清液即為丙二醛緩沖溶液。

（2）丙二醛含量的測定。收集上清液用磷酸緩沖液定容到7 mL，從中取1 mL，加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，搖勻。將試管放入沸水浴中煮沸10 min（自試管內(nèi)溶液中出現(xiàn)小氣泡開始計時）。10 min后立即將試管取出并放入冷水浴中，冷卻后，再次在4 ℃、8 000 g離心15 min（試管中若沒有沉淀，可不離心）。離心后，以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白分別測定532，600 和450 nm處的吸光值。

（3）丙二醛的數(shù)據(jù)處理方法。本試驗采取的是雙組分光光度法，丙二醛的濃度的計算方法為

MDA濃度（μmol·L-1）=6.45（D532-D600） -0.56D450

式中，D450、D532、D600分別代表450，532和600 nm波長下的光密度值。

MDA含量（μmol·g-1，F(xiàn)W）=MDA濃度（μmol·L-1） ×提取液體積（mL）/植物組織鮮質(zhì)量（g）

1.2.2 氧自由基的測量 （1）亞硝酸根準曲線的制作。最先配置出濃度50 μmol·L-1的NaNO2，再稀釋得到梯度濃度5，10，20，25，30，35，40，50 μmol·L-1。然后取1 mL NaNO2溶液，分別加入1 mL 17 mmol·L-1對氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol·L-1 a-萘胺，1 mL H2O，于250 ℃中保溫20 min，然后測定OD530，結果如表1。以[NO2-]和OD530值互為函數(shù)，按照試驗條件用計算機做標準曲線，得出回歸方程和相關系數(shù)，如圖1。

（2）植物提取液的制備。取歐李植物本年生葉，洗凈擦干剪碎，加入2 mL的50 mmol·L-1 pH 值7.8磷酸緩沖液[含0.1 mmol·L-1 EDTA;0.3%（W/V）Triton X-100;4%（W/V）聚乙烯局吡咯烷酮（pvpp，polyvinylpolyrrolidone）]進行研磨，研磨后加1mL 50 mmol·L-1 pH值7.8磷酸緩沖液洗研缽2次，以10 500×g離心20 min，得上清液并用緩沖液定容到8 mL，即為粗酶液。

（3）測定氧自由基含量。從粗酶液取1 mL，加0.5 mL 50 mmol·L-1 pH值7.8磷酸緩沖液，1 mL 1 mmol·L-1鹽酸羥胺，搖勻，于250 ℃中保溫1 h，然后再加入1 mL 17 mmol·L-1對氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol·L-1 a-萘胺（冰醋酸∶水=3∶1），搖勻，于250 ℃中保存20 min，取出測定波長OD530。

根據(jù)測得的OD530，查亞硝酸根標準曲線圖，將OD530換成亞硝酸根，然后依照羥胺與O-2.的反應式：NH2OH+2 O-2.+H+→NO2-+H2O2+H2O將[NO2-]乘以2，得到[O-2.]含量。

（4）計算亞硝酸根含量和氧自由基含量。由圖1（亞硝酸根標準曲線）可知，在選定工作范圍內(nèi)，亞硝酸根線性關系良好。亞硝酸根含量計算公式：

亞硝酸根含量=由標準曲線算得亞硝酸根濃度（μmol）×8（mL）提取液總量/ ?（樣品質(zhì)量（g）×1.0測定時提取液總量 （mL）） ?（1）

氧自由基含量=公式1算得的亞硝酸根含量×2 …4（2）

2 結果與分析

2.1 確定試驗方法

2.1.1 丙二醛測定方法的優(yōu)化 方法一：取0.2 g左右樣品，洗凈擦干，剪成小段放入研缽，加2 mL預冷的0.05 mol·L-1磷酸緩沖液，加入石英砂，冰浴條件下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到試管，用3 mL緩沖液分3次洗凈研缽，清洗液并入試管中。

向試管中加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，搖勻。放入沸水浴中煮沸10 min（內(nèi)液出現(xiàn)氣泡開始計時）。10 min后，立即將試管取出并放入冷水浴中，冷卻，4 ℃、8 000×g離心15 min。離心后，以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白測450， 532和600 nm處的吸光值。通過此方法得到如表2的數(shù)據(jù)。

一般吸光度在0.2～0.8之間，可以減少系統(tǒng)誤差。此方法測出的吸光度太大，不宜作為試驗數(shù)據(jù)。說明濃度太高，需要稀釋提取液。

方法二：同上，只是先把研磨得到的提取液定容到20 mL，取5 mL與0.5%硫代巴比妥酸（TBA）來反應。通過此方法得到如表3的數(shù)據(jù)。

可以看出此方法測出的吸光度偏大，不可作為試驗數(shù)據(jù)。說明需要離心。

通過以上的2個試驗分析，出現(xiàn)這種問題的可能原因在于合并提取液的時候，應該先離心，再反應。

方法三：同方法一，只是定容的時候定到7 mL，從中取1 mL與0.5%硫代巴比妥酸（TBA）來反應，通過此方法得到如表4的數(shù)據(jù)。

從表4中的吸光度可以確定此方法適宜測定歐李葉片中的丙二醛含量，具體如下。分別取植物當年生枝條葉片0.2 g左右，洗凈擦干，于預冷的研缽剪成小段，加2 mL預冷的0.05 mol·L-1 pH 值7.8的磷酸緩沖液，同時加石英砂，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到5 mL刻度離心試管，將研缽用3 mL緩沖液分3次洗凈，清洗液并入離心管中，在8 000轉(zhuǎn)·min-1，4 ℃下離心15 min，上清液即為丙二醛提取液。將上清液用磷酸緩沖液定容到7 mL，取1 mL提取液，加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，搖勻，在沸水浴中煮沸10 min（試管內(nèi)出現(xiàn)小氣泡開始計時）。10 min后立即將試管取出并放入冷水浴中冷卻，試管中若有沉淀，按上述條件離心15 min。以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白分別測定532 nm、600 nm和450 nm處的吸光值。

2.1.2 氧自由基測定影響因素的排除 （1）葉綠素影響。如果葉片中含有大量葉綠素將干擾測定，可在樣品測定時先去掉葉綠素，再進行測定試驗。去除葉綠素的過程可在研磨后進行，也可以在樣品與羥胺溫浴后萃取。在此過程中，提取液總量為2 mL，其他測定條件不變，結果如表5。

通過分析可以知道，不做處理的試驗組，結果較一致，而除去了葉綠素的試驗組，得到的氧自由基含量相差很大，因為在用乙醚萃取葉綠素的時候，體積影響很大，造成試驗結果誤差大。不做處理的樣品得到的氧自由基相對穩(wěn)定，因此試驗中不考慮葉綠影響。

（2）體積影響。由于要經(jīng)過研缽研磨，研磨后在研缽上都會留下一定的樣品，使得樣品提取液不為2 mL，這對試驗測定可能造成較大誤差，因此對體積影響做了試驗。一個是研磨時加2 mL 50 mmol·L-1 pH值 7.8磷酸緩沖液后直接離心，其余條件不變。另一個是在加入2 mL 50 mmol·L-1 pH值 7.8磷酸緩沖液后用1 mL 50 mmol·L-1 pH 值7.8磷酸緩沖液清洗2次，離心后定容到4 mL，結果如表6。

通過分析得到，從同一條件下取得的葉子，不考慮體積影響測定的氧自由基含量值較小，消除體積影響后測出來的氧自由基含量值較大。這表明體積對氧自由基含量測定有影響。所以確定此試驗在操作方法中采用消除體積影響的條件。

通過試驗，經(jīng)過分析，決定在試驗中不考慮葉綠素的影響，要考慮體積的影響。

2.2 短期水澇脅迫下丙二醛的含量變化

通過測歐李丙二醛生長期變化（11左右點取樣，每次做3個平行），測得丙二醛數(shù)據(jù)。由圖2可知，經(jīng)過水澇處理的歐李丙二醛含量在短期內(nèi)都比正常生長的歐李丙二醛含量高，說明水澇脅迫確實可以促使歐李產(chǎn)生丙二醛。在水澇脅迫下，短期內(nèi)丙二醛含量總體呈上升趨勢，說明短期內(nèi)水澇脅迫程度與歐李丙二醛含量呈正相關關系。

2.3 短期水澇脅迫下氧自由基的含量變化

由表7、圖3可以看出，脅迫處理組每天的氧自由基含量都要比對照組的要高，說明水澇脅迫可以促使歐李產(chǎn)生氧自由基。隨著時間增加，水澇脅迫程度加劇，氧自由基含量呈上升趨勢，但是上升過程有波動，這是因為植物體內(nèi)有自己的一套清除系統(tǒng)（抗氧化酶和抗氧化劑）[13]。當植物受到脅迫，體內(nèi)會產(chǎn)生POD，POD的主要作用就是分解氧自由基[14]，而在脅迫下，氧自由基增加，相應的POD也會增加，但是氧自由基的產(chǎn)生能力在短時間脅迫下比POD分解能力要強，故在短時間內(nèi)，歐李氧自由基含量呈波動上升的趨勢。

3 結論與討論

3.1 短期水澇脅迫下歐李丙二醛含量變化趨勢

短期內(nèi)，水澇脅迫下歐李丙二醛的含量比正常生長的要高。這是因為植物受到水澇脅迫會產(chǎn)生氧自由基，而氧自由基作用就是氧化細胞脂膜，其產(chǎn)物就含有丙二醛。同時從本試驗還可以看出，在本試驗條件下，丙二醛的含量呈上升趨勢。在短期內(nèi)，隨著水澇脅迫時間的增加，對植物的脅迫程度也增加，植物氧自由基量增加，導致脂膜氧化一直進行，丙二醛含量呈上升趨勢。

3.2 短期水澇脅迫下歐李氧自由基含量變化趨勢

短期內(nèi)，水澇脅迫下歐李氧自由基的含量比正常生長的要高，說明水澇脅迫有利于歐李產(chǎn)生氧自由基。水澇脅迫程度加劇，氧自由基含量將呈上升趨勢，但是上升過程有波動，這是因為植物體內(nèi)有自己的一套清除系統(tǒng)（抗氧化酶和抗氧化劑）。當植物受到脅迫時，體內(nèi)會產(chǎn)生POD，POD的主要作用就是分解氧自由基，而在脅迫下，氧自由基增加，相應的POD也會增加，但是氧自由基的產(chǎn)生能力在短時間脅迫下比POD分解能力要強，故在短時間內(nèi)，歐李氧自由基含量呈波動上升的趨勢。

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