胡艷芳+梁景山+耿宗帥+楊福+劉海軍

摘 ? ?要： 對(duì)冷凍保護(hù)劑種類(lèi)和胚胎發(fā)育階段對(duì)綿羊冷凍胚胎受胎率的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明： 分別以乙二醇、甘油為冷凍保護(hù)劑冷凍保存綿羊囊胚，解凍后移植受胎率差異不顯著，表明冷凍保護(hù)劑種類(lèi)對(duì)綿羊冷凍胚胎移植受胎率未有明顯影響;以乙二醇為冷凍保護(hù)劑，冷凍綿羊不同發(fā)育階段的胚胎，囊胚、擴(kuò)張囊胚解凍后移植受胎率均明顯高于桑椹胚的，囊胚和擴(kuò)張囊胚之間差異不顯著，表明胚胎發(fā)育階段對(duì)綿羊冷凍胚胎移植受胎率有顯著影響。

關(guān)鍵詞：乙二醇;甘油;胚胎發(fā)育階段;移植受胎率;綿羊

中圖分類(lèi)號(hào)：S814.6 ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.008

Effects of Cryoprotectents Kinds and Embryonic Development Stages on Pregnancy Rates of Frozen Sheep Embryos

HU Yan-fang1， LIANG Jing-shan1， GENG Zong-shuai2， YANG Fu2， LIU Hai-jun3

（1. Xiaying Animal Sciences and Veterinary Medicine Station， Tianjin 300193，China; 2. Ji County Animal Health Supervision and Inspection Institute， Tianjin 301900 ，China; 3. Tianjin Institute of Animal Sciences and Veterinary Medicine， Tianjin 300384，China）

Abstract： The effects of cryoprotectents kinds and embryonic development stages on pregnancy rates of frozen sheep embryos were deermined. The results showed that when ethylene glycol and glycerol was used as cryoprotectents separately， no significant difference was found in pregnancy rates of frozen sheep blastocysts， so cryoprotectents kinds had no effects on pregnancy rates. When ethylene glycol was used as cryoprotectents， the pregnancy rates of frozen sheep blastocysts and expanded blastocysts were significantly higher than that of morulas， but no significant difference was found between blastocysts and expanded blastocysts， so cryoprotectents kinds had significant effects on pregnancy rates.

Key words： ethylene glycol; glycerol; embryonic development stages; pregnancy rates; sheep

綿羊胚胎冷凍作為一種引種的手段，在引進(jìn)國(guó)外優(yōu)良的肉羊品種如杜泊[1-2]、薩福克[3]、無(wú)角陶塞特[4]綿羊時(shí)，以及在細(xì)毛羊育種中[5-6]已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。

影響胚胎冷凍效果的因素有多種，如胚胎質(zhì)量、發(fā)育階段、冷凍方法、冷凍保護(hù)劑種類(lèi)、受體發(fā)情時(shí)間及營(yíng)養(yǎng)狀況等。徐小波等[2]的研究表明，冷凍桑椹胚和囊胚階段的杜泊綿羊胚胎，移植后的受胎率囊胚顯著高于桑椹胚。而王永軍等[1]的研究表明，5、6日齡杜泊羊凍胚受胎率顯著高于4、7日齡胚胎。 Cocero等[7]對(duì)用乙二醇和甘油冷凍保存綿羊的桑椹胚和囊胚的冷凍效果進(jìn)行了比較，解凍后形態(tài)正常的胚胎移植后，用乙二醇冷凍的胚胎體內(nèi)發(fā)育率高于甘油的。

本研究采用程序冷凍法，采用不同的冷凍保護(hù)劑，以及對(duì)綿羊不同發(fā)育階段的胚胎進(jìn)行了冷凍保存和移植，目的在于建立一個(gè)適宜的綿羊胚胎冷凍保存體系，以獲得較為理想的胚胎存活和受胎率，為在綿羊胚胎移植產(chǎn)業(yè)化中大規(guī)模應(yīng)用胚胎冷凍技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供體羊超數(shù)排卵與沖胚

供體綿羊品種為薩?？撕偷廊兀挲g約2～3歲，舍飼。于供體羊陰道放置CIDA（新西蘭）的11～13 d，用促卵泡激素（FSH，Ovagen，新西蘭）遞減劑量連續(xù)超排3 d，每日2次，于最后一次注射FSH時(shí)撤栓。供體羊發(fā)情后配種，每間隔8～10 h配種1次，直至發(fā)情結(jié)束。

供體羊于發(fā)情的第7天（發(fā)情日為0 d）用手術(shù)法進(jìn)行子宮沖胚。選擇A級(jí)胚胎進(jìn)行冷凍保存，胚胎發(fā)育階段為致密桑椹、囊胚、擴(kuò)張囊胚。

1.2 胚胎冷凍

選擇A級(jí)致密桑椹胚、囊胚、擴(kuò)張囊胚進(jìn)行冷凍。冷凍液為1.5 mol·L-1乙二醇和10%甘油（ICP，新西蘭）。用兩種方法將胚胎加入冷凍液中：①乙二醇，胚胎一步加入冷凍液中，平衡10～20 min;② 甘油：胚胎分3步加入冷凍液中，3%甘油5 min，6%甘油5 min，10%甘油平衡15 min。胚胎冷凍儀為CL5500 （澳大利亞），冷凍程序?yàn)椋涸诶鋬鲆褐衅胶夂蟮呐咛?，裝入0.25 mL細(xì)管，放入冷凍室，在-6 ℃平衡5 min，植冰，繼續(xù)平衡10 min，然后以0.5 ℃·min-1降到-35 ℃，平衡10 min后投入液氮。

1.3 胚胎解凍

將胚胎細(xì)管從液氮中取出，在空氣中停留10 s，然后32 ℃水浴15 s，將胚胎從細(xì)管中推出，用兩種方法脫出冷凍保護(hù)劑：①乙二醇分三步脫除保護(hù)劑，在0.5 mol·L-1乙二醇+0.33 mol·L-1蔗糖（以Holding液為基礎(chǔ)液）中停留5 min;0.33 mol·L-1蔗糖停留5 min;Holding液洗3次。② 甘油分四步脫保護(hù)劑， 6%甘油+0.33 mol·L-1蔗糖5 min;3%甘油+0.33 mol·L-1蔗糖5 min;0.33 mol·L-1蔗糖5 min;Holding液5 min。

解凍后胚胎質(zhì)量的評(píng)價(jià)： A級(jí)胚胎，形態(tài)恢復(fù)完整，胚胎細(xì)胞團(tuán)緊湊;B級(jí)胚胎，透明帶破裂，或少量細(xì)胞游離出細(xì)胞團(tuán);C級(jí)胚胎，透明帶脫落或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)散。移植A、B級(jí)胚胎。

1.4 受體綿羊的同期發(fā)情和胚胎移植

受體綿羊?yàn)榻?jīng)產(chǎn)的小尾寒羊，年齡2～4歲，舍飼。注射前列腺素（上海）進(jìn)行同期發(fā)情處理。選擇發(fā)情第7天（發(fā)情日為0 d）的受體羊，采用腹腔鏡進(jìn)行子宮移植，胚胎移植于黃體好的一側(cè)子宮角，每只羊移植1枚胚胎。

1.5 妊娠診斷

胚胎移植后2個(gè)月，用B超機(jī)進(jìn)行妊娠檢查，以觀察到胎兒為妊娠依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍保護(hù)劑種類(lèi)對(duì)受胎率的影響

分別以乙二醇、甘油為冷凍保護(hù)劑，冷凍薩?？撕偷廊鼐d羊的囊胚，比較冷凍保護(hù)劑種類(lèi)對(duì)綿羊冷凍胚胎移植受胎率的影響。結(jié)果表明，以乙二醇、甘油為冷凍保護(hù)劑，冷凍胚胎移植受胎率分別為54.3%和51.5%，差異不顯著（P>0.05），表明冷凍保護(hù)劑種類(lèi)對(duì)綿羊冷凍胚胎移植受胎率未有明顯影響， 結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 胚胎發(fā)育階段對(duì)受胎率的影響

以乙二醇為冷凍保護(hù)劑，冷凍薩福克和道塞特綿羊的桑椹胚、囊胚和擴(kuò)張囊胚，比較不同胚胎發(fā)育階段對(duì)綿羊冷凍胚胎移植受胎率的影響。結(jié)果表明，囊胚、擴(kuò)張囊胚解凍后移植受胎率（59.6%，62.2%）均明顯高于桑椹胚的（40.2%）（P<0.05），囊胚和擴(kuò)張囊胚之間差異不顯著（P>0.05）。表明胚胎發(fā)育階段對(duì)綿羊冷凍胚胎移植受胎率有顯著影響，囊胚和擴(kuò)張囊胚的受胎率高于桑椹胚的，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討 ?論

3.1 胚胎冷凍保護(hù)劑的類(lèi)型對(duì)冷凍效果的影響

筆者在冷凍胚胎的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，使用甘油作冷凍保護(hù)劑，胚胎放入甘油中與乙二醇中的滲透行為是不同的，乙二醇滲入胚胎內(nèi)的速度很快，因此在顯微鏡下幾乎觀察不到胚胎形態(tài)的變化，而胚胎放入甘油中，胚胎發(fā)生嚴(yán)重皺縮，這是由于甘油分子量大，滲透入胚胎的速度慢，胚胎脫水造成的，隨著甘油滲入胚胎，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓達(dá)到平衡，胚胎才恢復(fù)原來(lái)的形狀。本研究從綿羊冷凍胚胎的移植受胎率看，甘油和乙二醇作冷凍保護(hù)劑的受胎率并沒(méi)有什么明顯差異，表明二者作為胚胎冷凍保護(hù)劑均是可行的。Cocero等[7]的研究表明，用乙二醇冷凍綿羊胚胎，比用甘油解凍后存活率高（64.4%比16.0%）;解凍后形態(tài)正常的胚胎移植后，用乙二醇冷凍的胚胎體內(nèi)發(fā)育率高于甘油（45.5%比27.7%），并因此得出結(jié)論用乙二醇冷凍綿羊胚胎比甘油效果好。這與本研究的結(jié)果有所不同，這可能與添加和脫除冷凍保護(hù)劑的方法不同以及受體等其它因素有關(guān)。Cocero等[8]進(jìn)一步揭示了用這兩種冷凍保護(hù)劑冷凍解凍的綿羊胚胎的超微結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，結(jié)果表明，用乙二醇冷凍的胚胎的卵裂球保持了高度的一致性，而用甘油冷凍的胚胎卵裂球受保護(hù)程度與卵裂球所處位置有關(guān)，尤其在桑椹胚，位于外部的卵裂球保存完整，而位于內(nèi)部的卵裂球完全破壞。

最初的胚胎冷凍所用的冷凍保護(hù)劑主要是甘油，在不同動(dòng)物的胚胎冷凍中表現(xiàn)了其有效性。由于甘油分子量較大，滲透速度慢，需要分步添加，較為繁瑣，不便于在胚胎移植產(chǎn)業(yè)化中應(yīng)用。目前的胚胎冷凍多采用乙二醇作冷凍保護(hù)劑，乙二醇分子量小，滲透速度快，因此需要的平衡時(shí)間短，可一步添加。

3.2 胚胎發(fā)育階段對(duì)冷凍效果的影響

用于冷凍的胚胎通常處于桑椹胚、囊胚、擴(kuò)張囊胚階段，處于不同發(fā)育階段的胚胎，其外觀形態(tài)和細(xì)胞數(shù)量及特性均有所不同，對(duì)冷凍的耐受能力也存在差異。本研究的結(jié)果表明，綿羊囊胚、擴(kuò)張囊胚冷凍解凍后移植受胎率均明顯高于桑椹胚的，囊胚和擴(kuò)張囊胚之間差異不顯著，表明胚胎發(fā)育階段對(duì)綿羊冷凍胚胎移植受胎率有顯著影響。這與徐小波等[2]的研究結(jié)果相似，冷凍桑椹胚和囊胚階段的杜泊綿羊胚胎，移植后的受胎率囊胚為61.5%，顯著高于桑椹胚 （41.5%）（P<0.01）。王麗娟等[9]、 陳永昌等[10]的研究也表明，綿羊冷凍胚胎囊胚的受胎率高于桑椹胚的。而王永軍等[1]則得出5、6日齡杜泊羊凍胚受胎率 （65.12%，63.64%） 顯著高于4、7日齡胚胎的（43.75%，45.45%）（P<0.01）。

從整體上看，冷凍發(fā)育階段晚的胚胎的受胎率高于早期的胚胎的。這其中的可能原因是，發(fā)育階段晚的囊胚和擴(kuò)張囊胚，其細(xì)胞數(shù)要較發(fā)育階段早的桑椹胚的細(xì)胞數(shù)多，而且細(xì)胞體積變小。與體積小的細(xì)胞相比，體積大的細(xì)胞不易充分脫水，因此冷凍效果差，這也是為什么卵母細(xì)胞和早期卵裂階段的胚胎不易冷凍成功的原因[11]。因此冷凍發(fā)育階段晚的胚胎的效果要好。

盡管使用羊胚胎的冷凍技術(shù)取得了較好的受胎率，但冷凍過(guò)程對(duì)細(xì)胞形態(tài)和代謝上的影響仍制約冷凍保存的成功率。常規(guī)的冷凍法并不能很好地保護(hù)細(xì)胞，避免冷凍所帶來(lái)的損傷，因此還需要進(jìn)一步完善胚胎冷凍保存體系[12]。

總之，采用常規(guī)的慢速冷凍方法，用乙二醇和甘油做冷凍保護(hù)劑，均能取得較高的受胎率，表明二者用于綿羊胚胎冷凍均是可行的，但考慮到在添加冷凍保護(hù)劑過(guò)程中甘油較乙二醇繁瑣，所以在胚胎移植產(chǎn)業(yè)化中用乙二醇較為合適。胚胎發(fā)育階段對(duì)移植受胎率有顯著影響，綿羊囊胚、擴(kuò)張囊胚冷凍解凍后移植受胎率均明顯高于桑椹胚的，因此，囊胚和擴(kuò)張囊胚是綿羊胚胎冷凍的適宜發(fā)育階段。

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