方 華，章建平#，張競超，章放香，王泉云，王儒蓉，劉 進

1)貴陽醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院麻醉科 貴陽550002 2)四川大學華西醫(yī)院麻醉科 成都610041

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI)是引起繼發(fā)性脊髓損傷的重要機制［1-2］。SCIRI 引起的輕癱或截癱發(fā)生率高達21%［3］。目前，SCIRI 發(fā)生的病理生理機制尚未完全闡明。瑞芬太尼聚己內酯(remifentanil-poly-caprolactone，REM-PCL)是由方華等［4］自行研制開發(fā)并已獲得國家正式授權的一種新型高分子Mu 阿片受體(Mu-opioid receptor，MOR)激動劑，前期研究已證實腹主動脈內灌注REM-PCL 0．1 mg/kg 預處理可能對SCIRI 具有重要的治療價值。為了進一步研究REM-PCL 對神經系統(tǒng)的保護機制，該研究觀察了SCIRI 模型兔腹主動脈內局部灌注REM-PCL 后體感誘發(fā)電位(somatosensory-evoked potential，SEP)的變化規(guī)律，并通過神經行為學評估和脊髓組織病理學觀察，探討REM-PCL 的脊髓保護作用。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 REM-PCL(中國發(fā)明專利號:200810045272．8)，阿片受體拮抗劑GSK1521498(美國Sigma 公司)，均溶解于5 mL 生理鹽水中。神經元特異性烯醇化酶(NSE)ELISA 檢測試劑盒(美國USCNLIEF 公司)，RevertAidTM第一鏈cDNA 合成試劑盒(美國Fermentas 公司)，BL-420S 生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，PCR 引物、β-actin 及3S Trizol 總RNA 提取試劑盒(上海博彩生物科技有限公司)。

1．2 SCIRI 動物模型的建立 采用左腎動脈下方腹主動脈夾閉法建立SCIRI 兔模型。經耳緣靜脈按30 mg/kg 的劑量注射戊巴比妥鈉麻醉兔后，右股部褪毛、常規(guī)消毒、鋪巾，逐層切開暴露，仔細分離并顯露右側股動脈，經右側股動脈向腹主動脈內置入硬膜外導管，使導管遠端位于左腎動脈起始點下方1 cm 處，固定導管，接傳感器測壓。置管前5 min 經耳緣靜脈注射肝素1 mg/kg。左腹股溝區(qū)備皮，消毒鋪巾，腹正中開腹后顯露腹主動脈及左腎動脈，并于左腎動脈分支下方約0．5 cm 處用動脈夾夾閉腹主動脈。證實股動脈平均動脈壓波形變?yōu)橹本€后，阻斷腹主動脈血流以造成腰段脊髓缺血損傷。阻斷45 min 后松鉗開放腹主動脈，恢復脊髓血液灌注，以造成腰段脊髓再灌注損傷。血壓穩(wěn)定后，取出導管，結扎右側股動脈，見腹主動脈搏動恢復、無血管嚴重損傷及腹腔滲血后，予甲硝唑10 mL 沖洗腹腔預防感染，確切止血，逐層關腹，觀察24 h。術中以生理鹽水浸潤的溫紗墊覆蓋腹腔臟器，直腸溫度維持于36～37℃。

1．3 實驗分組及處理方法 健康新西蘭大白兔30只(四川大學實驗動物中心提供)，雌雄不限，體重2．0～2．5 kg，手術當日晨禁食，按照隨機數字表法分為對照組、REM-PCL (R)組和 REM-PCL +GSK1521498組(RG組)，每組10只。R組和RG組按1．2 方法制備SCIRI 動物模型;對照組麻醉后僅進行手術操作，不阻斷腹主動脈。R組和RG組阻斷腹主動脈血流時，經腹主動脈局部灌注REM-PCL 0．1 mg/kg，5 min 內灌注完畢;RG組于REM-PCL 灌注結束后15 min 時再局部灌注GSK1521498 1 mg/kg，5 min 內灌注完畢;對照組局部灌注等容量生理鹽水。術中采用i-STAT 血氣分析儀(美國)間斷測定動脈血氣，連續(xù)監(jiān)測經皮脈搏氧飽和度、心電圖、平均動脈壓及直腸溫度。

1．4 觀察指標

1．4．1 SEP 測量 采用BL-420S 實驗系統(tǒng)，于阻斷前，再灌注15、30、60 min 及再灌注24 h 時測定SEP。刺激:將兩根直徑0．5 mm 單極銀針電極間距2．5 cm 插入左小腿腓腸肌，進行電脈沖刺激;刺激頻率4 Hz，強度5 mA。記錄:用ST-7 型腦立體定位儀固定兔頭部，顱骨正中矢狀線上17．5 mm、向右側旁開3．5 mm 處采用牙科鉆鉆開一直徑為3．0 mm的圓孔，顯露硬腦膜(相當于左后肢感覺投射區(qū))，并將直徑2．0 mm 無菌單極銀球記錄電極安放至圓孔內，保持電極與硬腦膜接觸良好且不損傷腦組織。SEP 起始潛伏期(OL)的記錄為刺激開始至P1 波波峰出現的時間，單位為ms;SEP 峰間波幅(IPA)為N1 波波峰至P1 波波谷的幅度，單位為μV;觀察SEP 形態(tài)(即波形)，包括各波的時空分布、位相和出現率。實驗結束后還原顱骨瓣并縫合頭皮。

1．4．2 血清NSE 的檢測 各組分別于阻斷前，再灌注15、30、60 min 及再灌注24 h 時自股靜脈采血5 mL，5 000 r/min 離心后取上清，采用雙抗體夾心ELISA 法測定血清NSE 質量濃度。

1．4．3 神經行為學評定 于再灌注6、12 和24 h時，由不了解分組情況的兩名觀測者進行動物后肢感覺、運動反射功能評估及神經功能評分，每例均測試3次，取其平均值。根據Reuter 等評分標準［5］進行綜合評價。

1．4．4 后角神經元計數 再灌注24 h 時，神經行為學評定完成后，再次麻醉兔，迅速完整取出L3～L4 節(jié)段脊髓組織固定于福爾馬林中，常規(guī)HE 染色，采用Olympus BX51 圖像采集分析系統(tǒng)等距隨機抽樣法觀察脊髓組織病理學變化，參照文獻［6］計數脊髓后角(Ⅰ～Ⅵ區(qū))正常和異常感覺神經元，并計算感覺神經元異常率。神經元異常率=所選視野中異常神經元數/該視野中神經元總數×100%。

1．4．5 MOR mRNA 的表達 再灌注24 h 時，神經行為學評定完成后，采用實時熒光定量PCR 法檢測脊髓組織中MOR mRNA 的表達。使用Primier 5．0軟件，根據PubMed 中基因序列設計MOR、β-actin的引物和探針。MOR 探針:5'-CTACAACATGTTC ACCAGCATCTTCACGCTCACCA-3'，MOR 正向引物:5'-AAGGCTGTGCTCTCCATTGAC-3'，MOR 反向引物:5'-CCCAACACCTGAAGCCAAGAC-3'。β-actin 探 針:5'-CAACGAGCGGTTCCGATGCCCT-3'，β-actin 正向引物:5'-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3'，β-actin 反向引 物:5'-CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA-3'。定 量方法參照文獻［7］。

1．5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16．0 進行統(tǒng)計處理。3組SEP、神經行為學評分和血清NSE 質量濃度的比較采用重復測量的方差分析，3組MOR mRNA 表達和感覺神經元異常率的比較采用單因素方差分析和SNK-q 檢驗，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 術后動物一般情況觀察 手術結束2 h 內動物均完全清醒。實驗過程中，實驗動物均無意外死亡，手術切口均愈合良好，無感染。對照組、R 和RG組截癱率分別為10/10、5/10 和8/10。

2．2 SEP 變化 見表1。再灌注后，3組兔SEP OL均延長，IPA 均降低。R組IPA 于再灌注30 min 時恢復至阻斷前水平，對照組和RG組于再灌注60 min 時恢復至阻斷前水平。再灌注期間各時間點，R組OL 均小于對照組和RG組。

表1 SEP 變化

2．3 神經行為學觀察 見表2。術前動物神經行為學評分均為0 分。再灌注各時間點3組后肢神經行為學評分均較術前顯著增加，但R組明顯低于對照組和RG組。

表2 神經行為學評分變化

2．4 血清NSE 質量濃度變化 見表3。

表3 3組血清NSE 質量濃度變化 μg/L

2．5 MOR mRNA 表達變化 見表4。再灌注24 h 時R組脊髓組織MOR mRNA 表達較對照組和RG組明顯增加。

2．6 感覺神經元異常率 見表4。再灌注24 h，R組感覺神經元異常率明顯低于對照組和RG組。

表4 3組再灌注24 h 脊髓組織中MOR mRNA 表達及感覺神經元異常率的比較

3 討論

研究［8］發(fā)現，MOR 在調節(jié)神經、精神、內分泌活動以及呼吸、心血管生理功能活動中具有重要作用。SCIRI 可引起脊髓組織中MOR mRNA 表達顯著降低，且MOR mRNA 表達變化與NSE 變化顯著相關，提示MOR 表達變化與SCIRI 引起神經元損傷的發(fā)生、發(fā)展有密切聯系，MOR 表達下降不利于缺血脊髓組織血液供應恢復后的神經功能恢復。REMPCL 為MOR 激動劑，極易通過血脊屏障。該研究觀察了腹主動脈內局部灌注REM-PCL 對SCIRI 兔SEP 的影響，探討REM-PCL 的脊髓保護作用。

研究中，預實驗結果表明，隨著腹主動脈內局部灌注REM-PCL 劑量的增加，實驗動物神經功能障礙逐漸減輕，表現為后肢神經功能的恢復及截癱率的下降，最佳劑量為0．1 mg/kg，故研究中0．1 mg/kg 為REM-PCL 實驗劑量。麻醉藥物不僅可以影響SCIRI 程度，還可能通過影響呼吸和循環(huán)系統(tǒng)引起缺氧，進一步加重脊髓損傷。一些靜脈麻醉藥物和心血管活性藥物對缺血神經元有明顯保護或損傷作用，如氯胺酮通過拮抗N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體而產生脊髓保護作用［9］。因此，實驗中僅靜脈注射30 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉動物并保留自主呼吸，且不應用其他具有心血管活性的藥物。實驗中腹主動脈阻斷和開放期間所有動物均未發(fā)生缺氧，血氣監(jiān)測值均無明顯變化，術后2 h 內動物完全蘇醒，說明研究采用的麻醉方式合適，并且0．1 mg/kg REM-PCL 的灌注劑量對內分泌系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等均無負性影響，未發(fā)生體溫降低、呼吸抑制和心律失常等不良反應，可以安全使用。采用阻斷腹主動脈方法主要引起L3～L4 脊髓節(jié)段損傷，同一節(jié)段主要累及前角及后角，與此同時，腹主動脈阻斷法建立SCIRI 模型具有經濟、手術操作過程簡單、重復性好以及缺血再灌注效果確切等特點。

研究［10-13］表明，SEP 作為客觀性和敏感性更好的檢測方法能夠準確地反映脊髓感覺功能受損的程度。SEP 經脊髓后索和后外側索傳導，能夠直接、客觀地反映脊髓感覺傳導束的機能狀態(tài)［14-16］。SEP IPA 主要與有效傳導纖維數目及動作電位大小有關，OL 主要與傳導路徑中的突觸數目、突觸延擱時間、神經髓鞘的脫失和受損有關［17-18］。SEP 與運動傳導束之間存在一定聯系，也可作為評價后肢運動功能的間接指標［19］。血清NSE 水平是一種測定方法簡便、特異性和敏感度高的神經元或神經細胞損傷標志。SCIRI 過程中，神經元細胞膜完整性破壞，NSE 由胞內釋放至胞外，通過血脊屏障進入循環(huán)［20］，提示外周血NSE 水平變化可反映SCIRI 程度及用于SCIRI 預后評估。

該研究結果顯示，對照組再灌注24 h 內實驗動物的SEP OL 逐漸并持續(xù)延長，IPA 于再灌注初期急劇降低，隨后逐漸恢復至阻斷前水平;與此同時，血清NSE 質量濃度隨著再灌注時間的延長而逐漸升高，并于再灌注24 h 時達到最高，說明神經元持續(xù)受損。RG組上述指標測值及變化趨勢與對照組相似。而再灌注期間R組OL 延長程度小于對照組和RG組，IPA 亦于再灌注30 min 時即恢復至阻斷前水平;與此同時，R組血清NSE 質量濃度雖然也升高，但始終明顯低于對照組和RG組，并于再灌注60 min 時開始降低，至再灌注24 h 時恢復至阻斷前水平;再灌注期間R組神經行為學評分始終低于對照組和RG組;再灌注24 h 時，R組脊髓組織MOR mRNA 表達水平明顯高于對照組和RG組，感覺神經元異常率明顯低于對照組和RG組。

該研究結果說明，阻斷-開放腹主動脈引起SCIRI 后脊髓損傷區(qū)域感覺神經纖維功能降低，有效傳導纖維數量減少，傳導速度下降，且受損傷的神經元興奮性下降，因此不能形成正常的SEP。REM-PCL對脊髓感覺傳導通路產生保護作用，使脊髓缺血期間感覺神經纖維及神經元破壞減少，可使缺血脊髓恢復血液灌注后感覺神經纖維及神經元功能恢復加快，在一定程度上增強了該通路將感覺神經形成的動作電位向大腦皮層傳遞的能力，該保護作用可能與MOR 的激活有關。

綜上所述，經導管腹主動脈內局部灌注REMPCL 預處理缺血脊髓組織可減輕SCIRI 引起的脊髓電生理功能損害，并具有促進損傷感覺神經纖維和神經元的電生理功能恢復的作用。

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