刁歡,湯強(qiáng),廖應(yīng)升 (安徽新華學(xué)院藥學(xué)院,安徽 合肥230088)
油茶是我國(guó)南方地區(qū)的一種木本油料作物,油茶粕是油茶經(jīng)榨油后的殘?jiān)?,是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的工業(yè)副產(chǎn)品。油茶粕營(yíng)養(yǎng)成分豐富,主要有粗蛋白(10%~15%),粗脂肪(5%),糖類(30%~40%)、粗纖維(15%~20%)和水分(14%),以及對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育有利的必需微量元素 Mg、Fe、Ca、Mn、Zn、Cu[1]。因此,油茶粕是一種優(yōu)良的天然植物蛋白資源,可作為優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料源。然而,由于油茶粕中含有茶皂素、單寧等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子,從而限制了其在飼料中的應(yīng)用。
單寧(Tannin)又稱單寧酸(Tannic acid)、鞣質(zhì),是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚類化合物的統(tǒng)稱,其相對(duì)分子質(zhì)量一般為500~3000。由于單寧味苦澀影響飼料的適口性,從而降低了動(dòng)物攝食率[2]。過量的單寧還可降低蛋白質(zhì)、氨基酸的消化率,并損傷腸壁,進(jìn)而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[3];再者,單寧可與消化道黏膜蛋白結(jié)合,形成不溶性復(fù)合物排出體外,增加了內(nèi)源氮的排泄量。研究表明,單寧酶可水解沒食子單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵,生成沒食子酸和葡萄糖,且單寧酶屬于誘導(dǎo)酶,主要利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)獲得[4,5]。因此,通過微生物發(fā)酵的方法產(chǎn)生單寧酶,促進(jìn)單寧的有效生物降解,是生產(chǎn)中將油茶粕轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料源的關(guān)鍵。本研究擬采用發(fā)酵過程中可產(chǎn)生單寧酶、發(fā)酵能力強(qiáng)的黑曲霉和酵母菌作為菌種[6,7],從溫度、pH、發(fā)酵時(shí)間等因素出發(fā),研究微生物固態(tài)發(fā)酵中單寧酶產(chǎn)生和單寧降解的最佳條件,并將單寧含量調(diào)控到對(duì)動(dòng)物體有益的范圍[8],以期為油茶粕作為蛋白質(zhì)飼料源使用提供理論依據(jù)。
1.1.1 菌種
黑曲霉、酵母菌購(gòu)于中國(guó)工業(yè)菌種保藏中心。
1.1.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基
油茶粕培養(yǎng)基:油茶粕13g、可溶性淀粉1g、尿素1.5g、磷酸氫二鈉0.05g、七水硫酸鎂0.015g、牛肉膏0.2g、七水硫酸亞鐵0.03g、酵母膏0.5g、蒸餾水100mL,自然pH,121℃滅菌20min。
PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15~20g、自來水1000mL,自然pH,121℃滅菌20min。
1.1.3 種子液的培養(yǎng)
酵母種子液的培養(yǎng):將酵母菌從斜面培養(yǎng)基接種至裝有50mL麥芽汁液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,30℃、160r/min培養(yǎng)24h。
霉菌種子液的培養(yǎng):將霉菌從斜面培養(yǎng)基接種至裝有50mLPDA液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,30℃、160r/min培養(yǎng)24h。
混菌按照接菌比例1∶1。
1.1.4 主要儀器設(shè)備
DA-180M型顯微鏡、AL204型電子天平、PHS-3C精密酸度計(jì)、HH-S型水浴鍋、Lac-5060S滅菌鍋、Lab-Tech SPX智能型培養(yǎng)箱、HZQ-QG型振蕩器、721型分光光度計(jì)。
1.2.1 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化
取培養(yǎng)基中的菌液,以10%的接種量接種于油茶粕培養(yǎng)基中,在恒溫30℃、pH 5的條件下進(jìn)行培養(yǎng),分別在發(fā)酵1、2、3、4、5、6d后取樣測(cè)定單寧的含量。設(shè)置未接菌種的油茶粕培養(yǎng)基作為對(duì)照組,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。
1.2.2 pH的優(yōu)化
取培養(yǎng)基中的菌液,以10%的接種量接種于油茶粕培養(yǎng)基中,恒溫30℃下,分別在pH為3、4、5、6、7、8條件下發(fā)酵3d后取樣測(cè)定單寧含量,設(shè)置未接菌種的油茶粕培養(yǎng)基作為對(duì)照,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。
1.2.3 發(fā)酵溫度的優(yōu)化
取培養(yǎng)基中的菌液,以10%的接種量接種于油茶粕培養(yǎng)基中,自然pH(pH 6.6~7.0)下,分別在10、15、20、25、30℃和35℃下發(fā)酵3d后取樣測(cè)定單寧含量,設(shè)置未接菌種的油茶粕培養(yǎng)基(發(fā)酵溫度30℃)作為對(duì)照,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。
單寧含量的測(cè)定方法采用分光光度法,參照林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《單寧酸分析試驗(yàn)方法》(LY/T 1642-2005)[9]進(jìn)行。
隨著發(fā)酵時(shí)間從1d逐漸增加到6d,不同菌種對(duì)油茶粕中單寧的分解能力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),其中混菌發(fā)酵油茶粕單寧含量在3d時(shí)降低到最小值0.52%(占油茶粕總量的比例),但隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至4~6d后,3個(gè)處理之間無顯著差異(P>0.05)(表1)。
隨著pH從3上升到8,不同菌種對(duì)油茶粕中單寧的分解能力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),其中混菌發(fā)酵油茶粕單寧含量在pH為5時(shí)降低到最小值,且顯著低于對(duì)照組和其他試驗(yàn)組(P<0.05),此時(shí)單寧含量為0.51%(表2)。
隨著發(fā)酵溫度從15℃上升到35℃,油茶粕中單寧的分解能力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。混菌發(fā)酵油茶粕的單寧含量在28℃時(shí)降低到最小值0.48%,顯著低于對(duì)照組和其他處理組(P<0.05)(表3)。
表1 不同發(fā)酵時(shí)間下不同菌種發(fā)酵后的油茶粕中單寧的含量
試驗(yàn)結(jié)果表明,不同發(fā)酵條件下,微生物發(fā)酵能夠有效降解油茶粕中單寧,且對(duì)單寧的降解能力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),其中黑曲霉和酵母菌的混菌試驗(yàn)組在發(fā)酵時(shí)間3d時(shí),油茶粕中單寧含量降低至0.46%,顯著高于其他試驗(yàn)組和對(duì)照組。
發(fā)酵時(shí)間為4d以上時(shí),各處理組之間單寧含量沒有顯著差異。綜合各菌種在不同時(shí)間段對(duì)油茶粕中單寧的降解結(jié)果,以混菌發(fā)酵效果最好,更符合實(shí)際生產(chǎn)要求。考慮到發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)帶來的生產(chǎn)成本的增加,以及油茶粕中單寧含量的升高,較適宜的發(fā)酵時(shí)間為3d。
溫度和pH對(duì)發(fā)酵結(jié)果的主要影響是其對(duì)微生物的生長(zhǎng)和相應(yīng)酶活性的影響[10]。研究表明,真菌和植物產(chǎn)單寧酶pH穩(wěn)定范圍一般在4~6之間[11]。當(dāng)混菌所分泌的單寧酶在pH為5時(shí),有最強(qiáng)的活性。本研究中pH在5左右時(shí),混菌對(duì)油茶粕中單寧的分解效果最顯著,表明此時(shí)混菌分泌的單寧酶有最強(qiáng)的活性。
本研究中,發(fā)酵起始溫度在28℃時(shí),混菌對(duì)油茶粕中的單寧具有顯著降解效果。這與蘇二正等[12]、郭魯宏等[13]的研究報(bào)道結(jié)果相符。28~32℃為黑曲霉最佳發(fā)酵培養(yǎng)溫度范圍,可能因?yàn)楸狙芯恐性囼?yàn)是在三角瓶中發(fā)酵,過程中產(chǎn)生了大量的熱,而物料的熱傳導(dǎo)率低,導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)熱量難以消散;此外,在發(fā)酵過程中物料的收縮和空隙的減少也使熱量難以消除,起始發(fā)酵溫度稍低,經(jīng)過發(fā)酵后發(fā)酵瓶?jī)?nèi)的溫度升高,酶活性增強(qiáng)。
表2 不同pH條件下不同菌種發(fā)酵后的油茶粕中單寧的含量
表3 不同發(fā)酵起始溫度條件下不同菌種發(fā)酵后的油茶粕中單寧的含量
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