金 雁，李曉東，劉 瑜，蔣 施，姜玲玲，周健南，鄭 晨

(1.沈陽(yáng)出入境檢驗(yàn)檢疫局，沈陽(yáng) 110016;2.上海愛(ài)博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海 200233)

抗生素是由微生物(包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬)或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞的發(fā)育功能。目前，抗生素主要用于治療動(dòng)物疾病，部分產(chǎn)品同時(shí)具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用。到目前為止，抗生素藥物在畜禽養(yǎng)殖中發(fā)揮著不可替代的作用。但是，在畜禽養(yǎng)殖中使用抗生素藥物會(huì)導(dǎo)致肉、蛋、奶中出現(xiàn)一定的殘留?？股貧埩袅窟_(dá)到一定程度時(shí)會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布了《動(dòng)物源性食品中獸藥殘留最高限量》，并適時(shí)修訂。目前，國(guó)家只批準(zhǔn)了土霉素、粘桿菌素、桿菌肽等20多種抗生素可作為飼料藥物添加使用，并嚴(yán)格規(guī)定了使用的動(dòng)物品種、生理階段、最低用量和最高用量、使用方法、停藥期和注意事項(xiàng)等。濫用抗生素將危及動(dòng)物、動(dòng)物性食品、環(huán)境甚至人類(lèi)的安全，所以監(jiān)控禁用或未批準(zhǔn)的抗生素是監(jiān)管部門(mén)的長(zhǎng)期工作。

抗生素的檢測(cè)方法主要有微生物分析法［1］、液相色譜法［2－5］、氣相色譜質(zhì)譜法［6－7］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等［8－10］。其中，以液相色譜法最常見(jiàn)，但方法選擇性差，靈敏度也達(dá)不到要求。近年來(lái)，隨著液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的普及，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室選擇該設(shè)備用于抗生素的監(jiān)控。液相色譜質(zhì)譜法常用來(lái)分析一類(lèi)或多種抗生素，利用保留時(shí)間和化合物的兩對(duì)離子進(jìn)行定性分析。但是由于抗生素種類(lèi)繁多，并且在分析過(guò)程中存在假陽(yáng)性的可能，所以本研究采用MRM篩查方法結(jié)合EPI譜庫(kù)對(duì)比功能，對(duì)可疑色譜峰進(jìn)行鑒定。該方法對(duì)保障我國(guó)食品安全具有重大的意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

儀器:ACQUITYTM超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司);AB Sciex Qtrap 5500三重四極桿－線性加速離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司);離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);Millipore純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司);MG－2200氮吹儀(美國(guó)EYELA公司);CPA 225D分析天平(德國(guó)Sartorius公司)。

試劑:雙氰胺、三聚氰胺、地美硝唑、甲硝唑、克球酚、噻苯達(dá)唑、磺胺脒、奧硝唑、呋喃唑酮、特布他林、沙丁胺醇、利巴韋林、替硝唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、新諾明、磺胺噻唑、喹乙醇、阿苯達(dá)唑、磺胺異噁唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、去氫睪酮、甲苯咪唑、芬苯達(dá)唑、磺胺喹惡啉、萊克多巴胺、甲睪酮、磺胺多辛、磺胺間甲基嘧啶、磺胺苯吡唑、奧芬達(dá)唑、呋喃它酮、頭孢氨芐、氨芐青霉素、阿莫西林、醋酸甲孕酮、醋酸氯地孕酮、林可霉素、萘夫西林、鄰氯青霉素、雙氯西林標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于Sigma公司。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水。采用1%的乙酸乙腈溶液進(jìn)行提取，用納濾級(jí)聚醚楓接枝的中空纖維素膜對(duì)樣品進(jìn)行凈化。標(biāo)準(zhǔn)品用少量乙腈溶解，色譜純乙腈定容配制1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)含量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃下保存，有效期為2個(gè)月。

1.2 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm，粒徑為 1.7 μm)，柱溫為 40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，流速為0.3 mL/min。流動(dòng)相A為超純水，B相為乙腈。起始B相為5%乙腈，1～10 min B相梯度變化到40%，10～15 min B相梯度變化為95%，15～18 min B相維持95%，18～18.1 min B相梯度變化為5%，保持5 min。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源:ESI+;噴霧電壓(IS):5500 V;霧化氣(GS1)流量:50 mL/min;氣簾氣(CUR)流量:30 mL/min;輔助加熱氣(GS2)流量:60 L/min;離子源溫度(TEM):600℃;碰撞氣流量:5 mL/min，4種氣體均為氮?dú)?Q1和Q3均為單位分辨率;ESI模式、去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)見(jiàn)表1。

表1 化合物MRM離子對(duì)信息及參數(shù)

續(xù)表

1.4 樣品前處理

取2 g樣品，置于50 mL離心管中，加入4 mL水渦混5 min，向離心管中加入10 mL 1%的乙酸乙腈溶液，均質(zhì)提取5 min;加入1 g氯化鈉和4 g無(wú)水硫酸鈉渦混振蕩1 min，6000 r/min離心10 min，取5 mL乙腈相到15 mL離心管中;加入5 mL正己烷渦混30 s進(jìn)行反萃取，靜置1 min，棄去上層正己烷層，重復(fù)反萃取步驟1次，得到反萃取后的乙腈相;在40℃下氮吹濃縮至0.3～0.5 mL，用乙腈定容至 1 mL，過(guò) 0.22 μm 濾膜;取濾液500 μL，轉(zhuǎn)移至聚醚楓接枝的中空纖維素膜組件中，4000 r/min離心8 min，收集濾液供 LC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物質(zhì)譜條件優(yōu)化

蠕動(dòng)泵以5 μL/min的流速連續(xù)注射，分別將43種質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.1 μg/mL的抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液注入ESI離子源，在正離子模式下逐個(gè)掃描優(yōu)化化合物。以萊克多巴胺為例，得到化合物的標(biāo)準(zhǔn)分子離子峰為［M+H］+302.2，優(yōu)化去簇電壓DP后得到最大強(qiáng)度的準(zhǔn)分子離子峰。逐步加大碰撞能量CE，找到準(zhǔn)分子離子峰最強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度CPS的子離子峰164.1和107.0，優(yōu)化2個(gè)碎片離子峰的碰撞能量。優(yōu)化的MRM離子對(duì)碰撞能和其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。按照預(yù)先優(yōu)化好的色譜條件采集43種抗生素的色譜圖，得到所有化合物質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10 ng/mL的總離子流圖(圖1)。

圖1 抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖

2.2 化合物譜庫(kù)建立

在基質(zhì)空白樣本添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后，控制進(jìn)樣質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10 ng/mL的樣本，分別設(shè)定20，35，50 eV碰撞能量的采集數(shù)據(jù)。將采集到的43種抗生素的二級(jí)質(zhì)譜圖添加到譜庫(kù)。同樣采集質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別設(shè)定20，35，50 eV的碰撞能量后，將二級(jí)質(zhì)譜圖添加到譜庫(kù)。此外，記錄化合物保留時(shí)間和MRM離子對(duì)信息建立文本庫(kù)(見(jiàn)表1)。

2.3 化合物篩查

將前面利用保留時(shí)間和MRM離子對(duì)建立的文本庫(kù)提取后整理為Excel格式存檔。存檔的格式可直接粘貼到操作軟件上。編輯液相色譜條件，建立MRM掃描方法，采集數(shù)據(jù)。對(duì)未知樣品進(jìn)行篩查，在化合物濃度達(dá)到或超過(guò)檢出限時(shí)采集樣本，目標(biāo)化合物一定會(huì)出現(xiàn)色譜峰。當(dāng)未知樣品篩查分析時(shí)出現(xiàn)MRM色譜峰，則認(rèn)定樣品為陽(yáng)性可疑樣品。

2.4 化合物鑒定步驟

MRM掃描方式是公認(rèn)的靈敏度最高的掃描方式，在編輯方法時(shí)設(shè)定離子對(duì)信息。如果樣本中含有MRM目標(biāo)化合物并且高于檢出限，則在總離子流圖上一定會(huì)出峰，然而出峰的不一定是目標(biāo)化合物。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)設(shè)定保留時(shí)間窗口以及MRM-IDA-EPI掃描方式采集保留時(shí)間窗口內(nèi)的色譜峰。色譜峰達(dá)到IDA設(shè)定閾值條件后激發(fā)EPI，對(duì)子離子掃描譜圖進(jìn)行富集，實(shí)現(xiàn)在低濃度下子離子掃描的可能。將采集的子離子掃描譜圖與本文2.2節(jié)中建立的標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，軟件自動(dòng)給出匹配值，并且還可通過(guò)肉眼直觀辨識(shí)色譜峰的純度以及真?zhèn)?，以?shí)現(xiàn)化合物鑒定步驟。

上述模式對(duì)實(shí)際陽(yáng)性可疑樣品進(jìn)行鑒定，獲得MRM提取離子流圖，同時(shí)采集陽(yáng)性可疑樣品的EPI譜圖進(jìn)行對(duì)比。

2.5 方法的檢出限、回收率

將43種抗生素混標(biāo)逐級(jí)稀釋至0.5～50 ng/mL系列濃度，采集MRM數(shù)據(jù)外標(biāo)法定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn):43種抗生素在0.5～50 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) r＞0.99。在 1，5，10 μg/kg 3個(gè)添加水平上，每個(gè)水平重復(fù)5次得到的平均回收率為69.3% ～102.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～18.3%。按照基線的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算檢出限，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 μg/kg時(shí)，信噪比均大于3;當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 μg/kg時(shí)，信噪比均大于10，定為定量限。

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究建立了畜禽產(chǎn)品中43種抗生素的篩查與鑒定方法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室自建的標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)可對(duì)陽(yáng)性可疑樣品進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)采用MRM-IDA-EPI步驟，同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)43種抗生素的監(jiān)控。該方法分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，可滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)畜禽類(lèi)產(chǎn)品的日常檢驗(yàn)和分析要求。

［1］邢進(jìn)，馮育芳，岳秉飛，等.微生物法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中的抗生素殘留［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2013，23(4):57－60.

［2］黃志勇，蔡洪基，黃高凌，等.水產(chǎn)品中四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留量的高校液相色譜測(cè)定方法［J］.福建分析測(cè)試，2005，14(1):2093－2096.

［3］吉彩霓，岳振峰，謝麗琪，等.高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中7種四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留的研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，2005，35(10):820－826.

［4］王寧，張芯蕊，陳海芹，等.制備高效液相色譜法分離純化牛蒡子木脂素［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013(5):65－68.

［5］楊柳，朱杰麗，吳翠蓉，等.基質(zhì)分散萃取——反相高交液相色譜法測(cè)定楊梅中氯［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013(2):408－412.

［6］田苗.豬組織中10種β－興奮劑類(lèi)獸藥殘留量的氣相色譜－質(zhì)譜法檢測(cè)［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2010，29(7):712－716.

［7］林維宣，董偉峰，陳溪，等.氣相色譜－質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物組織中多種激素類(lèi)獸藥的殘留量［J］.色譜，2009，27(3):294－298.

［8］那廣水，周傳光，王震，等.HPLC－MS/MS法同時(shí)測(cè)定近岸底棲生物中15種磺胺類(lèi)抗生素殘留量［J］.環(huán)境科學(xué)研究，2009，22(4):56－59.

［9］郭杰，張朝飛，高庚渠，等.高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用在牛奶抗生素殘留檢測(cè)中的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2014，41(1):236－239.

［10］郭德華，鄧曉軍，趙善貞，等.固相萃?。咝б合嗌V/串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物源性食品中76種獸藥殘留［J］.分析化學(xué)研究報(bào)告，2010，38(3):318－324.