瞿其揚(yáng)， 李存玉，2， 鄭云楓， 時 浩， 彭國平，2*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023；2.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023）

不同溶液體系中甘草酸的超濾分離規(guī)律研究

瞿其揚(yáng)1， 李存玉1，2， 鄭云楓1， 時 浩1， 彭國平1，2*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023；2.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023）

目的 探討不同溶液體系下甘草酸的超濾分離規(guī)律。方法 以甘草酸為實驗對象，在不同溶劑、藥液pH等條件下，選擇系列截留分子量的超濾膜進(jìn)行超濾，HPLC法計算甘草酸超濾前后的變化，分析不同條件下甘草酸存在狀態(tài)與其超濾行為的相關(guān)性。結(jié)果 含有相同濃度甘草酸的單體溶液與甘草提取液在相同條件下，超濾透過率具有明顯差異。此外，在酸性條件下甘草酸透過率降低，而在堿性條件下增加。在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液中，甘草酸透過率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而有不同程度增加。結(jié)論 不同溶液體系下甘草酸的存在狀態(tài)決定了其超濾透過行為，為超濾技術(shù)應(yīng)用于中藥制劑領(lǐng)域提供一定參考。

甘草酸；超濾；溶液體系；HPLC

超濾是一種以孔徑截留為特征的分離模式，依靠一定的壓力和體積流量，通過膜孔的篩分作用，迫使大分子物質(zhì)留下，小分子物質(zhì)透過［1］，具有操作簡單、能耗低、工藝流程短等優(yōu)點，在中藥制藥領(lǐng)域具有較大的開發(fā)潛力，尤其是中藥注射劑方面。但在實際應(yīng)用時，成分的分離規(guī)律與超濾膜截留分子量常出現(xiàn)相關(guān)性差的現(xiàn)象，僅依靠孔徑篩分理論往往無法解釋多樣性的超濾結(jié)果［2-3］，從而阻礙了超濾技術(shù)的推廣應(yīng)用，目前多歸結(jié)為溶液中的黏度、介電常數(shù)等因素引起［4-5］，而忽略同一成分在不同溶液環(huán)境中的存在狀態(tài)與其超濾行為的相關(guān)性。

由于中藥制劑中成分的多樣性，導(dǎo)致在同一溶液體系中，不同的成分均受到這一復(fù)雜環(huán)境的影響，會出現(xiàn)游離、解離、締合等形式［6-7］。由于成分存在形式的差異，其原本所具有的物化性質(zhì)也會發(fā)生相應(yīng)的改變，在進(jìn)行超濾時也會產(chǎn)生相應(yīng)的影響。因此，為了明確成分的超濾分離行為，首先需要制備不同的溶液體系，結(jié)合成分透過行為總結(jié)規(guī)律，進(jìn)而指導(dǎo)超濾技術(shù)的應(yīng)用。

本實驗選擇具有酸性、表面活性且在中藥制劑中較為常見的指標(biāo)成分甘草酸作為實驗對象，HPLC法分析超濾前后溶液中甘草酸的含有量，研究不同溶液體系下甘草酸透過率的變化，分析溶液環(huán)境-透過行為-存在狀態(tài)的相關(guān)性，為中藥超濾分離原理研究提供一定的參考。

1 儀器和材料

1.1 實驗儀器 Minipore Pellicon 2板框式超濾裝置、Minipore蠕動泵、超濾膜 （再生纖維素，截留分子質(zhì)量100、30、10、5、1 kDa） （美國Minipore公司）；Waters 2695 HPLC色譜儀（美國Waters公司）；AEL-40SM型電子天平 （十萬分之一，梅特勒-托利多上海有限公司）；PB-10型pH計 （德國賽多利斯公司）；FA2204型電子天平 （萬分之一，上海市安亭電子儀器廠）；H66025超聲清洗機(jī)（無錫市蘭輝超聲電子設(shè)備廠）。

1.2 材料 甘草酸提取物 （純度＞95%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號20120405）；甘草酸對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號110731-200614，供含有量測定用）。甲醇、乙腈為色譜純；三氟乙酸為分析純；水為純化水。

甘草飲片 （亳州市中正中藥材飲片有限公司，批號1305201），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為豆科植物烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖，符合 《中國藥典》2010版 （一部）有關(guān)項下的規(guī)定。

2 方法

2.1 供試品配制

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的甘草酸對照品適量，置于量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.561 8 mg/mL的甘草酸對照品溶液。

2.1.2 超濾原液的制備及預(yù)處理

2.1.2.1 甘草酸溶液 稱取甘草酸提取物適量，加水配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的藥液，超聲10 min，0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2.2 甘草提取液［8-9］稱取甘草藥材160.0 g，分別加10、8倍體積水回流，提取2.0、1.5 h，合并提取液，濃縮1.2倍后離心，0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2.3 甘草混合液 取甘草酸溶液和甘草提取液，等體積混合，超聲10 min，0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2.4 不同pH甘草酸溶液 稱取甘草酸提取物適量，加磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的藥液，pH值為3.0、9.0，超聲10 m in，0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2.5 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇甘草酸溶液 稱取甘草酸提取物適量，用10%、20%乙醇配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的藥液，超聲10 min，0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2 色譜條件［10-11］Thermo Scientific C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；乙腈為流動相A，0.1%三氟乙酸為流動相B，梯度洗脫，順序見表1；體積流量1 mL/min；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量10μL；柱溫30℃。

表1 梯度洗脫順序

2.3 超濾實驗

2.3.1 甘草酸超濾平衡實驗 取甘草酸溶液10 L，分別選擇100、30、10、5、1 kDa超濾膜進(jìn)行超濾，操作溫度25℃，操作壓力2 psi（1 psi=6.89 kPa），將超濾裝置中進(jìn)液端、截留液端及濾前原液端放于同一容器內(nèi)。當(dāng)超濾液端通量為原液體積的0.5、1、2、4、6倍體積時，取容器內(nèi)平衡液及超濾液，將不同平衡體積后的樣品進(jìn)行HPLC檢測，并按式 （1）計算甘草酸吸附率。

其中，R為成分的吸附率；C平衡為平衡液中甘草酸質(zhì)量濃度，單位為mg/mL；C原液為原液中甘草酸質(zhì)量濃度，單位為mg/m L。

2.3.2 甘草酸超濾實驗 超濾平衡實驗后，分別將甘草酸溶液、甘草提取液、甘草混合液、不同pH甘草酸溶液、不同體積分?jǐn)?shù)乙醇甘草酸溶液置于超濾系統(tǒng)中，采用系列孔徑超濾膜超濾，待充分平衡后取樣，進(jìn)而收集超濾液。超濾后，將超濾液端混勻，取樣，HPLC檢測超濾液、平衡液，根據(jù)式 （2）計算成分透過率T。

3 結(jié)果與分析

3.1 超濾規(guī)范操作 由圖1可知，10、30、100 kDa超濾膜平衡2～4倍溶液體積后，甘草酸吸附率較為穩(wěn)定，5和1 kDa超濾膜在平衡1～2倍體積后亦然。由于5和1 kDa

超濾膜通量較小，平衡1倍溶液體積所需時間較長，故根據(jù)吸附率總體趨勢變化，選擇平衡2倍溶液體積后取樣，結(jié)果相對穩(wěn)定，而且時間較為合適。

圖1 不同平衡體積下超濾膜對甘草酸的吸附率

3.2 不同溶液體系對甘草酸透過率的影響

3.2.1 甘草酸溶液、甘草提取液和混合液 三種溶液中，甘草酸透過率均隨膜孔徑增大而升高，其中甘草提取液與混合液中成分的透過率相當(dāng)。超濾膜在30 kDa以下時，提取液、混合液中甘草酸透過率均高于甘草酸單體溶液，見表2。

表2 不同藥液中甘草酸的透過率 （n=3）

3.2.2 不同pH值甘草酸溶液 甘草酸溶液pH約為5.3～5.5。隨著溶液pH降低，透過率呈明顯下降趨勢；溶液pH升高，透過率則隨之上升，見表3。

表3 不同溶液pH下甘草酸的透過率（n=3）

3.2.3 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的甘草酸溶液 乙醇使溶液中甘草酸透過率明顯高于單體水溶液。而且隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，甘草酸透過率有一定程度的上升，見表4。

表4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液中甘草酸的透過率 （n=3）

4 討論

4.1 超濾操作方法是影響實驗結(jié)果的關(guān)鍵因素之一，但現(xiàn)有文獻(xiàn)中鮮有關(guān)于超濾規(guī)范操作的報道，為避免操作等原因引起的結(jié)果多樣化，需要對超濾的取樣方法進(jìn)行系統(tǒng)性研究。本實驗選取2倍平衡體積后取樣，避免因超濾膜對成分吸附變化而導(dǎo)致數(shù)據(jù)不穩(wěn)，從而確保后續(xù)實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4.2 甘草提取液、混合液與相同質(zhì)量濃度甘草酸的單體透過率存在明顯差異，表明不同溶液體系對甘草酸超濾行為具有顯著影響。由于甘草酸屬于皂苷成分，在水溶液中易形成 “膠束”，阻礙其透過超濾膜［3］，在提取液中形成單分子鹽［12］而易于透過，說明溶液制備方式影響了成分存在形式，繼而影響其透過。而將兩種甘草酸溶液混合制備混合溶液進(jìn)行超濾時，甘草酸透過率并非介于兩者之間，而是較接近甘草提取液，這也說明混合溶液體系對甘草酸單體的超濾行為產(chǎn)生一定影響。

4.3 超濾法對不同溶液體系中甘草酸單體透過率的影響各異，可能與甘草酸具有表面活性有一定關(guān)聯(lián)。甘草酸親水端含有羧基結(jié)構(gòu)，在酸性條件下其解離受到抑制，與水分子親和力減小，有助于分子間形成膠束而被截留；堿性條件下其以離子形式存在，分子間排斥增大，致使分子團(tuán)聚作用減弱［13-14］，從而改變甘草酸單體的超濾效果。而在溶液中加入大量有機(jī)醇時，會抑制甘草酸膠束的形成［14］，并改善其疏水端的親水性，因此破壞了該分子團(tuán)聚的溶液條件，使甘草酸單體的透過率得到顯著提高。

4.3 綜上所述，不同溶液體系下成分的存在狀態(tài)有一定差異，使其透過行為發(fā)生改變，最終導(dǎo)致成分透過率的變化。因此，當(dāng)中藥成分進(jìn)行超濾時，可以通過篩選相應(yīng)溶液環(huán)境來改變成分透過率，以達(dá)到分離的目的，對超濾技術(shù)的推廣應(yīng)用有一定借鑒意義。但是，成分存在形式影響超濾行為的變化機(jī)制尚未明確，仍有待作進(jìn)一步分析研究。

［1］ 彭國平，郭立瑋，徐麗華，等.超濾技術(shù)應(yīng)用對中藥成分的影響［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2002，18（6）：339-341.

［2］ 繆菊連，黃照昌.三七總皂苷注射液的超濾工藝考察［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（2）：35-36.

［3］ 彭 菲，葉正良，李德坤，等.不同材質(zhì)及不同截留分子量超濾膜對人參皂苷類成分的影響［J］.中成藥，2013，35（5）：937-940.

［4］ 董 潔，郭立瑋，李玲娟，等.截留相對分子質(zhì)量1000的超濾膜對生物堿和環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的透過率及其定量構(gòu)效關(guān)系研究［J］.中國中藥雜志，2011，36（2）：127-130.

［5］ 郭立瑋.中藥膜分離領(lǐng)域的科學(xué)與技術(shù)問題［J］.膜科學(xué)與技術(shù)，2003，23（4）：209-213.

［6］ 戴幸星，王宇光，史新元，等.人參皂苷Ro膠束化影響因素的介觀模擬研究［J］.世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，14（4）：1767-1772.

［7］ 梁新華，李夢菊，鄭彩霞，等.兩親性光敏劑血卟啉單甲醚在不同溶液體系中的存在狀態(tài)［J］.中國激光醫(yī)學(xué)雜志，2005，14（3）：139-144.

［8］ 潘永蘭，黃 浩，顧 薇，等.不同預(yù)處理方法對無機(jī)陶瓷膜精制甘草水提液膜過程的影響研究［J］.化工時刊，2010，24（11）：11-15.

［9］ 張瑞斌，朱 彬，李 進(jìn)，等.甘草水提液對慢性腎衰大鼠腎功能的影響及機(jī)制研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，

2008，46（10）：994-997.

［10］ 孫國祥，王佳慶.HPLC數(shù)字化指紋圖譜控制甘草質(zhì)量［J］.中南藥學(xué)，2009，7（1）：51-54.

［11］ 尚曉娜，宋平順，楊 錫，等.HPLC梯度波長法同時測定甘肅省不同產(chǎn)地甘草中6種成分含量及主成分分析研究［J］.中國現(xiàn)代中藥，2012，14（9）：27-31.

［12］ 匡海學(xué).中藥化學(xué)［M］.二版.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2011：244-245.

［13］ 李賀敏，鄭云楓，彭國平，等.溫度、pH對甘草酸溶液中內(nèi)毒素團(tuán)聚狀態(tài)的影響［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（18）：20-22.

［14］ 鐘靜芬.表面活性劑在藥學(xué)中的應(yīng)用［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：113-115.

R284

B

1001-1528（2015）12-2775-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.047

2014-11-24

國家自然科學(xué)基金 （81373980，81503258）；江蘇省自然科學(xué)基金青年基金 （BK20151005）

瞿其揚(yáng) （1990—），男，碩士，研究方向為中藥化學(xué)與分析。Tel：18351895393，E-mail：18351895393@163.com

*通信作者：彭國平 （1963—），男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥成分分離精制及新藥研究。Tel： （025）86798186，E-mail：guopingpeng@sohu.com