胡選萍， 張曉娟， 任鵬斌， 苗夢瑤

（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723000）

不同激素對銀杏愈傷組織黃酮積累的影響

胡選萍， 張曉娟， 任鵬斌， 苗夢瑤

（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723000）

目的 研究不同激素對銀杏愈傷組織的影響，探討黃酮積累的最佳培養(yǎng)基。方法 以銀杏種子胚為材料，正交試驗(yàn)法確定2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6-芐基腺嘌呤與呋喃氨基嘌呤這4種激素對銀杏愈傷組織誘導(dǎo)及黃酮積累量的影響。結(jié)果 萘乙酸、6-芐基腺嘌呤與呋喃氨基嘌呤對銀杏種子胚愈傷誘導(dǎo)率與黃酮積累影響顯著。最佳愈傷組織誘導(dǎo)激素組合為1.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.1 mg/L 6-芐基腺嘌呤與0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤；最佳黃酮積累激素組合為3.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.5 mg/L 6-芐基腺嘌呤與0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤。結(jié)論 該條件下銀杏愈傷誘導(dǎo)率和黃酮產(chǎn)量較理想，可用于銀杏愈傷積累黃酮的培養(yǎng)。

銀杏；愈傷組織；激素；黃酮積累；正交試驗(yàn)

銀杏Ginkgo biloba L.是國際上近代植物藥研究開發(fā)的熱點(diǎn)之一［1-2］，《本草綱目》記載，其 “性味甘苦而澀，入肺、腎二經(jīng)，有定喘止咳、止帶濁、縮小便” 的功效［3］。銀杏提取物主要含有銀杏黃酮和萜類內(nèi)酯這兩大活性成分，其中前者包括槲皮素、異鼠李素、山柰素這3種苷元與糖基結(jié)合形成的黃酮醇苷，而后者主要由白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C組成。據(jù)報(bào)道，黃酮類成分在抗氧化、抗衰老、提高免疫機(jī)能和防治心血管疾病方面療效顯著［4-5］，已經(jīng)在醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛開發(fā)。目前，利用銀杏愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)黃酮類次生代謝產(chǎn)物成為近年來發(fā)展的新領(lǐng)域［6-7］，但由于其品質(zhì)與特性差異，往往造成產(chǎn)量偏低，很難滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。許多研究者從不同角度探索銀杏離體培養(yǎng)條件及激素類物質(zhì)對銀杏愈傷誘導(dǎo)與黃酮積累的影響［8-10］，但相關(guān)研究多采用單因素和雙因素試驗(yàn)，并未綜合分析各種激素組合的優(yōu)化效果。本實(shí)驗(yàn)以銀杏種子胚為試材，以2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6-芐基腺嘌呤與呋喃氨基嘌呤這4種激素為考察因素，采用4因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析不同激素組合處理對銀杏愈傷組織誘導(dǎo)和黃酮積累的影響，并優(yōu)化其條件，為后期的懸浮培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)提供一定技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 銀杏Ginkgo biloba L.種子采自陜西省漢中市陜西理工學(xué)院校園內(nèi)約30年生銀杏樹的當(dāng)年生種子。2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6-芐基腺嘌呤與呋喃氨基嘌呤均為分析純。MS為基本培養(yǎng)基，自制。

1.2 儀器 LDZX-50FBS型立式壓力滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-2D型雙人單面潔凈工作臺 （上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司）；HHS-4S電子恒溫不銹鋼水浴鍋 （上海軋艮儀器設(shè)備有限公司）；722G型可見分光光度計(jì) （上海圣科儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 選取色澤鮮亮、大小一致的銀杏種子，剝掉肉質(zhì)外種皮，流水沖洗30 min，裝入消毒好的廣口瓶中，75%乙醇表面消毒30 s，0.1%升汞（HgCl2）浸泡10 min，處理過程中不斷搖動，以保證消毒液與試材充分接觸，無菌蒸餾水沖洗4～5次，每次2～3 min，置于無菌濾紙上吸干水分。無菌操作時剝開種子，取出胚，接種至附加不同激素組合的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于溫度（25±2）℃、散射光條件下培養(yǎng)30 d，即可誘導(dǎo)出愈傷組織。

1.3.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇 以MS為基本培養(yǎng)基，以2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6-芐基腺嘌呤與呋喃氨基嘌呤為考察因素，選用L9（34）正交表，每個因素設(shè)3個水平，見表1。

1.3.3 愈傷組織的繼代培養(yǎng) 將各處理誘導(dǎo)出的愈傷組織在對應(yīng)培養(yǎng)基 （與誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素種類與濃度配比相同）中連續(xù)繼代3次后，測定黃酮的含有量。

1.3.4 總類黃酮的提取與測定 參照文獻(xiàn) ［11-12］，采用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定黃酮含有量。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏愈傷組織的誘導(dǎo) 將銀杏種子胚外植體接種到不同激素的培養(yǎng)基上，第3天開始有少量愈傷組織形成，5～10 d是愈傷的快速誘導(dǎo)期，2周左右達(dá)到高峰，第30天所有處理均可誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)100% （圖1）。大多試驗(yàn)處理誘導(dǎo)出的愈傷組織為黃綠色 （圖2），少數(shù)為白色、綠色或淺黃色，愈傷組織質(zhì)地疏松或致密，生長情況也不盡量相同 （表2）。

圖1 不同培養(yǎng)時間愈傷誘導(dǎo)率比較

圖2 銀杏胚誘導(dǎo)的愈傷組織

表2 銀杏種子胚愈傷組織誘導(dǎo)的基本情況

2.2 對愈傷誘導(dǎo)率的影響 激素的種類和濃度是銀杏愈傷組織培養(yǎng)的重要影響因素。由于第10天是銀杏愈傷組織誘導(dǎo)的拐點(diǎn)，之后誘導(dǎo)率基本趨于穩(wěn)定 （圖1），因此將這時期各激素對誘導(dǎo)率的影響進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，有助于判斷其效應(yīng)水平及篩選銀杏愈傷誘導(dǎo)的最優(yōu)組合。以愈傷誘導(dǎo)率為指標(biāo)，進(jìn)行直觀分析與方差分析，結(jié)果見表3和表4。由表3可知，各因素對銀杏愈傷誘導(dǎo)率的影響依次為C＞D＞B＞A，即6-芐基腺嘌呤＞呋喃氨基嘌呤＞萘乙酸＞2，4-二氯苯氧乙酸，最佳激素組合為A1B1C1D2，即培養(yǎng)基中的激素組合為1.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.1 mg/L 6-芐基腺嘌呤與0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤。由表4可知，萘乙酸、6-芐基腺嘌呤與呋喃氨基嘌呤對銀杏愈傷誘導(dǎo)率具有顯著影響，而2，4-二氯苯氧乙酸則無明顯影響。

表3 銀杏愈傷組織誘導(dǎo)的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表4 銀杏愈傷誘導(dǎo)率的方差分析

2.3 對黃酮積累量的影響 以銀杏愈傷組織中的黃酮含有量為指標(biāo)，分別進(jìn)行直觀分析 （表5）與方差分析 （表6）。由方差分析結(jié)果可知，萘乙酸、6-芐基腺嘌呤與呋喃氨基嘌呤對銀杏愈傷組織中的黃酮積累具有顯著影響（P＜0.01），而2，4-二氯苯氧乙酸則無明顯影響。通過直觀分析比較4個因素的極差值，發(fā)現(xiàn)D最大，其次是C，B較小，而A最小，其效應(yīng)依次為呋喃氨基嘌呤＞6-芐基腺嘌呤 ＞萘乙酸 ＞2，4-二氯苯氧乙酸，最優(yōu)組合為A3B1C3D2，即培養(yǎng)基中激素組合為3.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.5 mg/L 6-芐基腺嘌呤與0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤。

表5 銀杏黃酮含有量的正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 銀杏黃酮含有量的方差分析

3 討論

激素作為植物生長調(diào)節(jié)劑，對愈傷組織的誘導(dǎo)有著獨(dú)特的調(diào)控作用。胡蕙露等［13］研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中萘乙酸和6-芐基腺嘌呤的質(zhì)量濃度分別為0.5 mg/L與0.1 mg/L，當(dāng)附加0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤時，有利于銀杏莖段愈傷組織誘導(dǎo)。王洪善等［14］報(bào)道，以銀杏嫩莖作外植體組織培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基激素配比為0.8～1.0 mg/L萘乙酸與1.0 mg/L 6-芐基腺嘌呤。朱紅威等［15］研究結(jié)果表明，激素對胚的愈傷化程度影響比較大，6-芐基腺嘌呤較呋喃氨基嘌呤更有利于愈傷組織的誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)將4種激素同時配合使用，取得了良好的愈傷誘導(dǎo)效果，雖然各試驗(yàn)組在培養(yǎng)30 d后均能誘導(dǎo)出愈，但在愈傷組織快速形成期存在明顯差異。綜合考慮各激素對愈傷誘導(dǎo)效應(yīng)、愈傷品質(zhì)以及愈傷組織生長量的影響，發(fā)現(xiàn)有利于銀杏愈傷組織誘導(dǎo)的最優(yōu)激素組合為1.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.1 mg/L 6-芐基腺嘌呤與0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤。激素之間的相互作用非常復(fù)雜，不同激素如何影響愈傷形成速度而不影響最終誘導(dǎo)水平尚有待作進(jìn)一步研究。

在組織培養(yǎng)中，因培養(yǎng)目的與材料的不同，在培養(yǎng)基中通常加入一種或幾種激素類物質(zhì)，其質(zhì)量濃度或組合的稍加改變，往往能造成次生代謝產(chǎn)物含有量的顯著變化。如哈斯其美格等［16］在唐古特大黃研究中發(fā)現(xiàn)，2.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸非常有利于蒽醌的積累。Carrier等報(bào)道［17］，萘乙酸與6-芐基腺嘌呤組合可提高銀杏黃酮苷的含有量。胡燕梅等［18］發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度激素0.1 mg/L萘乙酸與0.5 mg/L 6-芐基腺嘌呤有助于銀杏胚愈傷組織中黃酮積累。本實(shí)驗(yàn)采用4因素3水平正交設(shè)計(jì)，顯示萘乙酸、6-芐基腺嘌呤與呋喃氨基嘌呤對銀杏愈傷組織中的黃酮含量具有顯著影響，而且當(dāng)培養(yǎng)基中激素組合為3.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.5 mg/L 6-芐基腺嘌呤與0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤時，最有利于黃酮的積累。朱紅威等［15］研究發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)銀杏胚愈傷組織產(chǎn)黃酮的最佳激素組合為0.3 mg/L 6-芐基腺嘌呤與2.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，黃酮含有量最高可達(dá)到0.013 mg/kg，而本實(shí)驗(yàn)采用繼代3次的愈傷組織為試材，各試驗(yàn)組黃酮平均含有量達(dá)0.023 5 mg/kg，但愈傷組織在長期繼代中是否能始終保持較強(qiáng)的次生代謝物的合成能力值得作進(jìn)一步研究。

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R284

B

1001-1528（2015）12-2787-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.050

2015-03-06

陜西省科技廳自然科學(xué)專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目 （2014K14-03-03）

胡選萍 （1975—），女，碩士，講師，從事植物資源開發(fā)及生物技術(shù)研究。E-mail：pingxh2010@126.com