蘭國謙，劉建秋

（1.河北省環(huán)境保護(hù)產(chǎn)業(yè)協(xié)會，石家莊 050090；2.河北工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，石家莊 050090）

城市內(nèi)河流藻類控制的研究

蘭國謙1，劉建秋2

（1.河北省環(huán)境保護(hù)產(chǎn)業(yè)協(xié)會，石家莊 050090；2.河北工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，石家莊 050090）

城市內(nèi)河流藻類暴發(fā)會嚴(yán)重影響水體的水質(zhì)。在闡述城市內(nèi)河藻類控制必要性的基礎(chǔ)上，提出了采用生物活性物質(zhì)控制藻類繁殖的設(shè)想，并確定了實驗研究路線和方法。通過初步實驗，確定了生物活性物質(zhì)在控制藻類方面具有良好效果。

城市河流污染；藻類控制；生物活性物質(zhì)

城市內(nèi)的河流具備供水、生物保護(hù)與景觀等多種生態(tài)服務(wù)功能，其以社會、經(jīng)濟(jì)與環(huán)境價值推動了城市的發(fā)展。但隨著城市的發(fā)展，大量生活污水、雨水、生活垃圾排入河流，導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了河道及周圍的生態(tài)系統(tǒng)，導(dǎo)致河流生態(tài)系統(tǒng)逐漸退化[1]。近年來，由于水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致藻類過量繁殖，造成水華的出現(xiàn)，成為了影響水域生態(tài)系統(tǒng)安全以及附近居民健康的主要因素[2]。不少國內(nèi)外研究者認(rèn)為，水華的突然消亡可能與感染溶藻菌有關(guān)。溶藻菌作為防治水華的有效微生物引起了越來越多的關(guān)注[3]。其中，溶藻活性物質(zhì)的研究是溶藻菌研究的熱點[4]。

本文以石家莊市的民心河為研究對象，通過分離純化溶藻細(xì)菌，提取溶藻物質(zhì)，研究溶藻機(jī)理，為藻類的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種及溶藻菌

取民心河中富營養(yǎng)化的水體為研究對象，進(jìn)行水華藍(lán)藻的分離培養(yǎng)，選用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)藻種，藻種在25℃、光照強(qiáng)度為2500lx及光暗比為12h : 12h條件下培養(yǎng)。溶藻菌以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)，置于4℃冷藏保存，使用前活化。

1.1.2 培養(yǎng)基

溶藻細(xì)菌的基本培養(yǎng)基[5]：NH4H2PO41g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖 5g， NaCl 5g，K2HPO41g，蒸餾水1000mL。改良培養(yǎng)基：NH4H2PO41g，MgSO4·7H2O 0.2g，檸檬酸三鈉 0.5g，K2HPO41g，蒸餾水 1000mL。

藻類的培養(yǎng)采用BG11改良培養(yǎng)基：NaNO3150mg，K2HPO44mg，MgSO4·7H2O 7.5mg，CaCl2·2H2O 3.6mg，Na2SiO3·9H2O 5.8mg，檸檬酸0.6mg，檸檬酸鐵銨0.6mg，EDTA 0.1mg，Na2CO32mg，A5溶液0.1mL，蒸餾水99.9mL。A5溶液：H3BO3286mg，MnCl2·4H2O 181mg，ZnSO4·7H2O 22mg，CuSO4·5H2O 7.9mg，Na2MoO4·2H2O 3.9mg，蒸餾水100mL.

1.2 實驗方法

1.2.1 河流水質(zhì)監(jiān)測

測定指標(biāo)有化學(xué)需氧量（COD）、五日生化需氧量

（BOD5）、總磷、總氮、懸浮物（SS）水質(zhì)指標(biāo)參照《城市污水再生利用景觀環(huán)境用水水質(zhì)》（GB/T18921-2002）標(biāo)準(zhǔn)對水質(zhì)進(jìn)行定級。

1.2.2 溶藻實驗

（1）溶藻細(xì)菌的分離和純化。采用對比實驗方法，第一組實驗是在基本培養(yǎng)基試驗的基礎(chǔ)上，分別每次減少基本培養(yǎng)基的一種成分，進(jìn)行溶藻實驗比較；第二組實驗是把基本培養(yǎng)基中各成分按培養(yǎng)基中的量配成溶液，各組分別進(jìn)行溶藻實驗比較。溶藻實驗中選取對數(shù)生長期的藻類，培養(yǎng)基與藻接入比例為1 : 10，每天定時取樣，測藻葉綠素a含量。

（2）溶藻細(xì)菌的檢測、篩選及篩選方法的優(yōu)化。采集的水樣首先經(jīng)0.8μm的纖維濾膜過濾，濾液再經(jīng)0.22μm的纖維濾膜過濾，收集0.22μm的纖維濾膜。把收集的0.22μm的纖維濾膜剪成小份，分別投入到供試藻種中，對照組投入未經(jīng)使用的0.22μm的纖維濾膜，培養(yǎng)1～2周，將對照組生長正常及實驗組黃化的藻液再轉(zhuǎn)接入新鮮的供試藻種中，仍有黃化現(xiàn)象的藻液作為分離溶藻細(xì)菌的材料。

對黃化藻液進(jìn)行稀釋，制成10-3，10-4，10-5稀釋液。將已滅菌尚未凝固的固體培養(yǎng)基分別倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，待凝固后將不同稀釋度的菌懸液混勻，各吸取一定量置于相應(yīng)編號的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，涂布在平板上，倒置于30℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，在分離細(xì)菌的平板上挑取單菌落，再次采取劃線法，使菌種進(jìn)一步純化，保存純培養(yǎng)菌株。純化菌株接種于培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，收集細(xì)菌細(xì)胞并用生理鹽水洗滌3次制成目的菌。

（3）篩選菌株的鑒定和溶藻特性的研究。在改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h的菌培養(yǎng)液，細(xì)菌濃度為5×108cfu/mL，分別取10mL接入到90mL的供試藻種中，對照組均加入10mL的改良基本培養(yǎng)基，觀察溶藻效果：取菌培養(yǎng)液10mL，5mL，1mL接入到90mL的銅綠微囊藻中，菌液接入量不足10mL的以改良基本培養(yǎng)基補(bǔ)足，對照組加入10mL的改良基本培養(yǎng)基，觀察溶藻效果。

2 結(jié)果

2.1 民心河水質(zhì)監(jiān)測

河流普遍存在水體水質(zhì)超標(biāo)，富營養(yǎng)化，藻類繁殖產(chǎn)生臭味，城市環(huán)境狀況令人擔(dān)憂。表1是水質(zhì)監(jiān)測結(jié)果，對照《城市污水再生利用景觀環(huán)境用水水質(zhì)》（GB/ T18921-2002）標(biāo)準(zhǔn)可知，COD、BOD5、總氮、懸浮物超標(biāo)嚴(yán)重，水質(zhì)屬于Ⅴ類水標(biāo)準(zhǔn)，為水體藻類繁殖創(chuàng)造了有利條件，藻類控制研究勢在必行。

表1 民心河水質(zhì)指標(biāo)分析表 （單位mg/L）

2.2 主要水華藻類的分離及鑒定

通過分離純化得到若干株藍(lán)藻，經(jīng)鑒定有銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）、水華魚腥藻（Anabaena flosaguas）和聚球藻（Synechococcus sp1）。

2.3 菌種的篩選與培養(yǎng)

原準(zhǔn)備通過藻類培養(yǎng)，提取其產(chǎn)生的活性物質(zhì)，因此，從河水采集一定量的水樣，通過在容器中靜置沉淀，除去其中的雜質(zhì)，然后篩選單一菌種，放在發(fā)酵液中進(jìn)行培養(yǎng)。采取的條件是30℃條件下培養(yǎng)，光強(qiáng)4000lx，3d后提取上清液，用于銅綠微囊藻的抑制實驗，但效果不夠理想；將基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行初步改良，培養(yǎng)后的溶藻細(xì)菌進(jìn)行抑菌試驗，效果也不夠理想。分析原因可能是因為藻類本身產(chǎn)生的活性物質(zhì)受到各種影響，因此在實驗室現(xiàn)有的培養(yǎng)條件下不能產(chǎn)生更多的活性物質(zhì)所致。

2.4 采購活性物質(zhì)進(jìn)行溶藻實驗

基于水樣藻類自己不能很好地提取活性物質(zhì)，故采購了蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)，基于4℃冷藏保存。使用前對其進(jìn)行培養(yǎng)，其分泌的胞外活性物質(zhì)對銅綠微囊藻進(jìn)行控制實驗。

研究設(shè)計了6組試驗，即用活性物質(zhì)加入后，經(jīng)過連續(xù)培養(yǎng)6d，測定藻類的含量，由此確定抑藻效果。加入前后測定銅綠微囊藻的含量，采用的方法是丙酮法。即用丙酮提取葉綠素a，用葉綠素a的含量表示藻類的含量。分別測定殺藻效果，查看抑藻作用效果。經(jīng)過實驗研究確定的6d前后數(shù)據(jù)對比見表2。

表2 蠟狀芽孢桿菌活性物質(zhì)溶解銅綠微囊藻實驗結(jié)果

3 討論

3.1 城市內(nèi)河流水質(zhì)生物控制措施

城市內(nèi)河流具有空間相對封閉、與外界的交換緩慢；水體人工化、生物種類少、生態(tài)系統(tǒng)脆弱；容易受到人類活動干擾，恢復(fù)困難等特點。對于藻類的繁殖，可以采取置換河水、人工打撈水面漂浮物、加大清淤力度、化學(xué)方法滅藻、投放魚苗吃藻和種植水體植物吸收營養(yǎng)物質(zhì)等措施，生態(tài)修復(fù)作用顯著。

生態(tài)修復(fù)是指利用大自然的自我修復(fù)能力在適當(dāng)?shù)娜斯ご胧┹o助下，恢復(fù)其原有的生態(tài)功能的過程。河流生物修復(fù)工程包括植物凈化工程、生物凈化工程、化學(xué)凈化處理和微生物技術(shù)運用等[6]。具體處理技術(shù)如下。

3.1.1 植物凈化工程

利用生態(tài)浮床技術(shù)，在水面上用泡沫塑料搭建浮床，種植經(jīng)過專門篩選和培育的植物，如：美人蕉、水竹、空心菜、水稻、香蒲、水蔥、前屈菜、黃菖蒲、睡蓮，利用其發(fā)達(dá)的根系，有效地吸收和分解水體中的有毒物質(zhì)，起到凈化水體的作用。

3.1.2 生物凈化工程

在河流沿岸建設(shè)生物--生態(tài)水質(zhì)凈化設(shè)施，去除COD等化學(xué)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，減少藻類生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，通過控制食物減少藻類繁殖，保持良好水質(zhì)[7]。

3.1.3 化學(xué)凈化處理

對于藻類等生物物質(zhì)可以采取加入化學(xué)藥劑殺藻，或加入鐵鹽促進(jìn)磷的沉淀，或加入石灰進(jìn)行脫氮，減少營養(yǎng)物質(zhì)或直接殺死微生物，控制藻類繁殖，保證水體穩(wěn)定。

3.1.4 微生物技術(shù)運用

采用復(fù)合酶技術(shù)治污。在水底噴灑一種含有多種生物酶、非離子型表面活性劑、營養(yǎng)成分及蛋白質(zhì)的濃縮液體，促進(jìn)有機(jī)物在水體中的乳化和溶解，并刺激和加速微生物的生化反應(yīng)?；蚶梦⑸锛夹g(shù)。在水體中投放經(jīng)過培養(yǎng)和篩選的好氧、兼氧和厭氧微生物菌群，通過微生物的呼吸發(fā)酵，將有機(jī)物等容易造成水體黑臭的物質(zhì)迅速分解為二氧化碳和水。

從以上分析可知，符合生態(tài)規(guī)律的生物控制技術(shù)是未來發(fā)展的方向，采用生物活性物質(zhì)控制藻類是一項新的生物控制技術(shù)，必將得到很好的應(yīng)用。

3.2 生物活性物質(zhì)控制藻類的研究

化感作用在水生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在，存在于植物之間以及植物和微生物之間，包括相互刺激作用和相互抑制作用。植物化感作用是通過向環(huán)境釋放化學(xué)物質(zhì)而實現(xiàn)的，這些起作用的化學(xué)物質(zhì)稱為化感物質(zhì)。但是，由于自然條件各種因素的影響，如營養(yǎng)物質(zhì)和光照的競爭、溫度和pH值的變化都會對水生植物的化感作用產(chǎn)生干擾[8]。

溶藻細(xì)菌的作用方式一般分為兩種：1）直接溶藻，即直接進(jìn)攻宿主，其需要細(xì)菌與溶藻細(xì)胞直接接觸，甚至侵入藻細(xì)胞內(nèi)；2）間接溶藻，即間接進(jìn)攻宿主，主要包括細(xì)菌同藻競爭有限營養(yǎng)或細(xì)菌分泌胞外物質(zhì)溶藻。其中，間接分泌胞外物質(zhì)溶藻是溶藻細(xì)菌的主要作用方式。

細(xì)菌可以通過釋放特異性或非特異性的胞外物質(zhì)，如：蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、抗生素和羥胺等殺死藻細(xì)胞。常見的該類細(xì)菌有弧菌、假單胞菌、黃桿菌、交替單胞菌、假交替單胞菌等。

假交替單胞菌A28（Pseudoalteromona sp.A28）能產(chǎn)生細(xì)胞外大分子物質(zhì)，殺死骨條藻，靠的是蛋白質(zhì)活性物質(zhì)溶藻，一旦加熱，蛋白質(zhì)失去活性就會降低或失去溶藻作用。鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）能夠分泌一種對微囊藻有強(qiáng)烈殺滅活性的多肽argimicin A物質(zhì)，對綠色微囊藻（Microcystis viridis NIES-102）和銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）具有很強(qiáng)的殺藻活力?；【鷮俚燃?xì)菌能產(chǎn)生具有殺藻作用的生物活性物質(zhì)氨基酸，能控制顫藻（Oscillatoria amphibian NIES-361）的繁殖。銅綠假單胞菌能釋放低分子質(zhì)量、熱抗性物質(zhì)，對綠藻和藍(lán)藻的生長有強(qiáng)烈的抑制作用。硝化細(xì)菌通過氧化銨或其他還原性的氮化合物釋放的羥胺含氮化合物能抑制小球藻。另外，假交替單胞菌可分泌細(xì)胞外物質(zhì)溶藻，葡萄球菌、芽孢桿菌、節(jié)球桿菌均可釋放出某種物質(zhì)溶藻[9]。

4 結(jié)論

實驗表明，加入活性物質(zhì)的試管培養(yǎng)液的顏色相對透明清澈，銅綠微囊藻出現(xiàn)明顯的色素減褪，部分細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的破碎現(xiàn)象，部分細(xì)胞出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象；加入量對溶解藻類影響較大，通過實驗表明，保持活性物質(zhì)濃度在25mg/kg左右效果最佳。而對照組液體逐漸變綠，銅綠微囊藻的生長沒有受到任何抑制。

該實驗表明：微生物活性物質(zhì)對藻類有很好的控制效果，最大抑制率達(dá)到85%以上。但藻類控制的條件還需要進(jìn)一步實驗研究確定。

[1]Aguiar F C，F(xiàn)erreira M T，Moreira I.Exotic and native vegetation establishment following channelization of a western Iberian river[J].Regulated rivers：research & management，2001，17：509-5261.

[2]張晟，李崇明，鄭丙輝，等.三峽庫區(qū)次級河流營養(yǎng)狀態(tài)及營養(yǎng)鹽輸出影響[J].環(huán)境科學(xué)，2007， 28（3）：500-505.

[3]丁西明，傅以鋼，夏四清，等.溶藻系統(tǒng)中微生物的群落結(jié)構(gòu)研究[J].中國給水排水，2009，23 （25）： 104-108.

[4]李小彩，裴海燕，胡文容.溶藻細(xì)菌及溶藻物質(zhì)研究進(jìn)展[J].工業(yè)水處理，2007，27（6）：10-12.

[5]趙斌，何紹江.微生物學(xué)實驗[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[6]石鳳，張雁秋，李艷芬.水體富營養(yǎng)化的預(yù)防及治理辦法[J].環(huán)境科學(xué)與管理.2008，33（2）：144-147.

[7]鄧柳，王麗風(fēng)，胡開林.三種除藻劑處理滇池水的探討[J].凈水技術(shù).2006，25（1）：72-74.

[8]關(guān)英紅，馬軍.富營養(yǎng)化水體中微藻的生物控制技術(shù)發(fā)展動態(tài)[J].水資源保護(hù)，2008，24（6）：1-6.

[9]崔妍，李建宏，汪燕，等.高效抑藻放線菌的篩選和活性[J].生態(tài)學(xué)報.2008，28（11）：5691-5698.

Study on Alga Control in Inner Rivers of Cities

LAN Guo-qian, LIU Jian-qiu
(1. Hebei Association of Environmental Protection Industry, Shijiazhuang 050090, China; 2. Hebei Institute of Industry Vocational Technology, Shijiazhuang 050090, China)

Based on the necessity of alga control in inner rivers of the cities, the paper puts forward the considerations in adopting bio-active compounds to control alga proliferation and confirm the experimental research route and methods. Through the primary experiments, the paper confirms the good effects of bio-active compounds in controlling alga.

river pollution of city; alga control; bio-active compound

X524

A

1006-5377（2015）12-0043-04