何晶，耿仁德，計紅，馬莉，張虹亮，孔凡志，程曉旭，楊煥民

（1.黑龍江省農(nóng)墾哈爾濱管理局動物衛(wèi)生監(jiān)督所，哈爾濱 150090；2.黑龍江省農(nóng)墾總局建三江分局勤得力農(nóng)場第六管理區(qū)；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院）

海蘭褐蛋雞卵巢與輸卵管FSHR及LHR基因定量的研究

何晶1，耿仁德2，計紅3，馬莉3，張虹亮3，孔凡志3，程曉旭3，楊煥民3

（1.黑龍江省農(nóng)墾哈爾濱管理局動物衛(wèi)生監(jiān)督所，哈爾濱 150090；2.黑龍江省農(nóng)墾總局建三江分局勤得力農(nóng)場第六管理區(qū)；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院）

為了研究雞卵巢、輸卵管子宮部、輸卵管漏斗部FSHR及LHR基因表達水平差異，實驗從海蘭褐蛋雞的子宮部、卵巢、漏斗部中提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)獲得FSHR、LHR目的基因，并應(yīng)用實時熒光定量PCR進行定量檢測。結(jié)果顯示卵巢組織FSHR mRNA表達水平顯著高于子宮部與漏斗部組織（P＜0.01），子宮部與漏斗部組織FSHR mRNA表達水平?jīng)]有顯著性差異；子宮部組織LHR mRNA表達水平極顯著高于其他兩組（P＜0.01），但卵巢、漏斗部組織LHR mRNA表達水平?jīng)]有顯著性差異。實驗通過研究雞卵巢、輸卵管子宮部、輸卵管漏斗部FSHR及LHR基因表達水平差異，研究為今后研究禽類生殖生理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

蛋雞；促卵泡激素受體；促黃體生成素受體；基因表達量；熒光定量

促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）是家禽生殖系統(tǒng)的主要調(diào)控激素，其他有許多激素是通過對這兩種激素分泌的影響而間接發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的。FSH是垂體分泌的一種糖蛋白激素，是促進和維持性腺的正常發(fā)育和生殖功能的重要激素。它的生理作用是通過分布于顆粒細(xì)胞的特異性受體—FSH受體（FSHR）所介導(dǎo)。黃體生成素受體（Luteinizing hormone receptor，LHR）屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族

中的糖蛋白亞家族成員[1]，可以加快卵巢的血液循環(huán)，促進被FSH預(yù)處理過的卵泡成熟并誘發(fā)排卵。盡管LH對卵泡發(fā)育和排卵的作用明顯，但這種影響往往與其和FSH的協(xié)同是分不開的。

禽類的卵巢是產(chǎn)生卵細(xì)胞的部位；輸卵管漏斗部，即輸卵管的傘狀部，是運送卵細(xì)胞和提供受精的部位，也是卵子的受精部位。而子宮部（殼腺部）主要是形成石灰質(zhì)卵殼，防止細(xì)菌的侵入。目前，作為FSH和LH兩種生殖激素受體FSHR與LHR在上述部位的表達水平少有研究，因此研究主要應(yīng)用熒光定量PCR法檢測海蘭褐蛋雞輸卵管子宮部、卵巢、輸卵管漏斗部FSHR及LHR受體基因表達水平，為今后研究禽類生殖生理、產(chǎn)蛋性能及生殖激素與抱性方面的學(xué)者提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 樣品采集和試劑

選取實驗室飼養(yǎng)的產(chǎn)蛋期海蘭褐雞6只，通過科學(xué)飼養(yǎng)并同時記錄產(chǎn)蛋情況，可提前預(yù)測排卵時間。臨檢健康后，取海蘭褐蛋雞的卵巢、輸卵管的子宮部和漏斗部樣品，置于-80℃保存。

實驗中采用的試劑主要有氯仿，異丙醇，乙醇，DEPC處理水，TRIzol，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，TaKaRa Taq，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，DNA marker，DNA凝膠回收與純化試劑盒，6*loading Buffer，培養(yǎng)液（Hyclone M199），瓊脂糖，Tris，EDTA，熒光染料等。

1.2 提取顆粒細(xì)胞總RNA

從-80℃冰箱中取出裝有卵巢、輸卵管子宮部和漏斗部樣品各0.2 g，置于液氮預(yù)冷的研缽中用石英砂研磨至無可見顆粒。參考Trizol法RNA提取試劑盒操作說明提取細(xì)胞總RNA。

1.3 總RNA質(zhì)量的檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳與核酸定量分析儀鑒定RNA質(zhì)量和濃度。

檢測總RNA濃度及其純度：將1 μL總RNA溶解于99 μL DEPC處理水中，應(yīng)用核酸定量分析儀測定提取的RNA的OD值，OD260與OD280之間的比值應(yīng)在1.6～2.0之間。

檢測總RNA完整性以及有無嚴(yán)重的污染現(xiàn)象：取1 μL總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測5 S、18 S和28 S三條帶，從而確定提取的總RNA是否能用于下一步試驗。

1.4 PCR引物設(shè)計與合成

參考NCBI上注冊發(fā)表的FSHR、LHR以及GAPDH（內(nèi)參）原雞核苷酸序列，利用Primer Primer5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計擴增海蘭褐蛋雞FSHR、LHR以及GAPDH基因的引物，以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物如下表1所示。

表1 目的基因引物與PCR擴增產(chǎn)物長度Table 1Primers of purpose gene and product length of PCR amplification

1.5 RT-PCR反應(yīng)

分別加入1 μL 50 μM的Oligo（dT18），4 μL DEPC處理水到各樣品提取的1 μL總RNA模板中，總體積為6 μL。均勻混合后70℃水浴10 min，取出后迅速放置于冰上2 min。離心使混合液沉于管底。在管中加入2 μL的5xM-MLV Buffer，0.5 μL的 10 mM的dNTP，0.25 μL的40 U·μL-1RNase Inhibitor，0.25～1 μL的DEPC處理水，使總體積為10 μL。混勻后42℃水浴60 min。完成上步驟，則置于70℃水浴15 min，取出后在冰上急冷1 min，離心使溶液沉于管底。將獲得的cDNA用于下步PCR擴增試驗。

1.6 PCR反應(yīng)體系

將反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板，設(shè)計合成的FSHR、LHR和GAPDH基因的引物進行PCR反應(yīng)，擴增達到相應(yīng)的基因片段。50 μL PCR體系如表2：cDNA模板1.0 μL；10×PCR Buffer 5.0 μL；P1（20 pmol·μL-1）1.0 μL；P2（20 pmol·μL-1）1.0μL；dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1each）8.0 μL；Taq酶（5 U·μL-1）0.5 μL，加水至總體積50 μL。

擴增FSHR基因的PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 sec，56℃退火30 sec，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。擴增LHR基因的PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 sec，52℃退火30 sec，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。GAPDH在以上兩個PCR反應(yīng)參數(shù)下均能反應(yīng)。每個樣品設(shè)3個重復(fù)孔，利用實時熒光PCR儀進行擴增。PCR反應(yīng)后吸取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行凝膠檢測，由于所擴增的基因片段都小于400 bp，故選用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳來檢驗擴增的結(jié)果，并應(yīng)用紫外燈觀察結(jié)果。

1.7 基因測序驗證

從瓊脂糖膠上切下與預(yù)期大小一致的PCR擴增產(chǎn)物，用DNA片段純化試劑盒進行純化，將其與PMD-18-T載體進行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布與氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃溫育12 h，挑取白色單個菌落，轉(zhuǎn)移有約3～4 mL氨芐抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37℃過夜。堿裂解法小劑量制備質(zhì)粒，酶切和PCR鑒定，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程公司進行測序。測定結(jié)果應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAstar與引物設(shè)計所參考的DNA序列，進行同源性分析，從而驗證PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。

1.8 熒光定量

使用SYBR Premix Ex TaqⅡ（寶生物染料法熒光定量試劑盒）進行熒光定量試驗，反應(yīng)體系與1.6一致。

2 結(jié)果

2.1 總RNA電泳結(jié)果

提取的蛋雞組織總RNA，在1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，圖1中可看到28 S、18 S和5 S這幾條帶。從上至下可觀察到，28 S條帶最亮，18 S條帶略暗，5 S條帶較暗，由此可知，提取的RNA較為完整，符合繼續(xù)試驗的要求。核酸蛋白測定儀測定RNA的OD260/280值在1.80～2.00之間，同樣也符合試驗要求。

圖1 RNA提取結(jié)果Fig.1Agarose gel electrophoresis of total RNA

2.2 RT-PCR擴增目的片段結(jié)果

采用RT-PCR擴增目的片段后，1%瓊脂糖凝膠電泳。將凝膠置于紫外燈下觀察，觀察到與預(yù)期大小相符的目的條帶（86 bp、207 bp、191 bp），且PCR擴增的產(chǎn)物條帶單一，證明引物序列設(shè)計特異性較高，結(jié)果如圖2。

圖2 GAPDH，F(xiàn)SHR，LHR目的基因PCR產(chǎn)物Fig.2Agarose gel electrophoresis of PCR product for GAPDH，F(xiàn)SHR and LHR

2.3 核酸序列測定結(jié)果與序列分析

利用DNAstar等軟件分別對GAPDH、FSHR、LHR、基因重組質(zhì)粒核酸序列，將其與參考序列進行同源性分析（進行序列對比時，上排序列為了試驗擴增的雞基因，下排為NCBI上發(fā)表的原雞基因），結(jié)果如下。

GAPDH核酸測序結(jié)果與原雞比對同源性為98.9%，如圖3：

圖3 克隆蛋雞GAPDH基因片段與NCBI發(fā)表的原雞序列的同源性分析Fig.3Homology analysis of the target gene segment of GAPDH clone and NCBI gallus

FSHR核酸測序結(jié)果與原雞比對同源性為96.2%，如圖4。

圖4 克隆蛋雞FSHR基因片段與NCBI發(fā)表的原雞序列的同源性分析Fig.4Homology analysis of the target gene segment of FSHR clone and NCBI gallus

LHR核酸測序結(jié)果與原雞比對同源性為98.95%，如圖5。

圖5 克隆蛋雞LHR基因片段與NCBI發(fā)表的原雞序列的同源性分析Fig.5Homology analysis of the target gene segment of LHR clone and NCBI gallus

2.4 熒光定量檢測mRNA表達結(jié)果

應(yīng)用熒光定量儀檢測輸卵管子宮部、卵巢、輸卵管漏斗部三組中FSHR和LHR的表達情況（見圖6和圖7）。結(jié)果顯示：如圖6子宮部與漏斗部FSHR表達水平差異不顯著，卵巢組織FSHR mRNA表達水平與其他兩組存在極顯著性差異（P＜0.01）；圖7卵巢與漏斗部LHR表達水平差異不顯著，子宮部LHR mRNA表達水平與其他兩組存在極顯著差異（P＜0.01）。

圖6 FSHR mRNA的表達情況Fig.6Gene expression quantities of FSHR mRNA

圖7 LHR mRNA的表達情況Fig.7Gene expression quantities of LHR mRNA

3 討論

與哺乳動物一樣，禽類生殖活動也主要受生殖軸下丘腦、垂體、性腺軸的激素調(diào)節(jié)，受GnRH對促性腺激素細(xì)胞的刺激，垂體中促卵泡素（FSH）開始合成、分泌、轉(zhuǎn)運[2]并最終作用于卵巢和睪丸的FSHR，合成并分泌相應(yīng)的生殖腺激素參與繁殖行為的調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)促黃體素（LH）等激素的合成與釋放，從而促進卵泡的發(fā)育和成熟，對動物繁殖性狀的調(diào)控起著重要作用。在過去的十多年里，人們也逐漸發(fā)現(xiàn)FSH和LH除了影響傳統(tǒng)的性腺靶位點（如卵巢）外，促性腺激素受體還存在于整個生殖道的輸卵管、子宮內(nèi)膜、子宮肌層、子宮頸和子宮血管中[3]。

FSHR與LHR分別是FSH與LH發(fā)揮作用的結(jié)合位點，F(xiàn)SH和LH在動物繁殖領(lǐng)域具有重要作用，即能夠調(diào)節(jié)性腺發(fā)育，調(diào)控性激素的分泌，維持動物第二性征和性行為，這使FSHR和LHR成為提高禽類產(chǎn)蛋性能的研究目標(biāo)之一。方弟安等研究發(fā)現(xiàn)皖西白鵝在產(chǎn)蛋前1周FSHβ mRNA表達維持較高水平直至產(chǎn)蛋10天達最高，到休產(chǎn)期和就巢前期迅速下降，進入就巢末期，F(xiàn)SHβ mRNA水平在此上升達到較高水平[4-5]。FSHβ mRNA水平規(guī)律性變動說明FSH與皖西白鵝的產(chǎn)蛋關(guān)系密切[7]。試驗檢測了LHR和FSHR在蛋雞的子宮部、卵巢、漏斗部的表達量差異，結(jié)果顯示子宮部、卵巢、漏斗部FSHR存在顯著差異，卵巢FSHR極顯著高于其他兩個部位，提示實驗動物正處于產(chǎn)蛋高峰期，卵巢機能處于良好水平。輸卵管漏斗部的FSHR有具有較高的表達量，因為漏斗部是禽類卵泡受精部位，提示FSH與FSHR結(jié)合后對禽類的受精有重要作用。

黃體生成素（LH）是由垂體前葉促黃體素細(xì)胞（嗜堿性細(xì)胞）產(chǎn)生的一種糖蛋白激素，在FSH的協(xié)同作用下促使排卵，形成黃體并分泌孕激素。在雌禽的排卵周期內(nèi)，由于垂體不斷釋放FSH和LH，刺激卵泡生長發(fā)育，不斷生長的卵泡合成孕酮逐漸增加，刺激垂體釋放LH，當(dāng)孕酮對垂體的刺激達到一定的闡值，引起LH的大量釋放，使排卵前的LH達峰值，高水平的LH作用于成熟的卵泡促發(fā)排卵[8]。LH是潛在的能夠調(diào)節(jié)輸卵管功能的循環(huán)激素中的一種，并且已經(jīng)在人、牛、豬和山羊的輸卵管中證實了LHR的存在[9-10]。但是在研究中發(fā)現(xiàn)子宮部LHR mRNA顯著高于其他兩組，漏斗部和卵巢之間差別卻不顯著，提示LH對雞輸卵管子宮部功能可能有較大的調(diào)節(jié)作用。

實驗成功提取了總RNA，反轉(zhuǎn)了cDNA，成功的通過熒光定量PCR的技術(shù)檢測LHR和FSHR在蛋雞的子宮部、卵巢、漏斗部的表達量差異，為探索禽類產(chǎn)蛋性能機制奠定了重要基礎(chǔ)。

［1］Menon K M，Munshi U M，Clouser C L，et al.Regulation of luteinizinghormone/humanchor-ionicgonadotropin receptor expression：a perspective［J］.Biol Reprod，2004，70（4）：861-866.

［2］陳永華.自然光周期條件下種鵝血清生化指標(biāo)、生殖激素水平和組織中GnRH、FSH基因表達量的研究［D］.揚州：揚州大學(xué)，2012.

［3］申穎，侯志高，王樹迎.促性腺激素受體在子宮和輸卵管中分布和作用的研究進展［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2007，28（6）：86-88.

［4］方弟安，耿照玉，羅朝暉，等.皖西白鵝生殖周期中PRL、E2、LH和P4變化規(guī)律的研究［J］.上饒師范學(xué)院學(xué)報，2009，29（3）：71-76.

［5］姜潤深，杜曉東，陳興勇，等.皖西白鵝繁殖周期中垂體FSHmRNA的表達規(guī)律［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，15（6）：84-88.

［6］謝佳，陳忠，王博，等.熱應(yīng)激對蛋雞繁殖性能影響研究進展［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2011，32（6）：112-115.［7］姜潤深，杜曉東，陳興勇，等.皖西白鵝繁殖周期中垂體FSH mRNA的表達規(guī)律［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，15（6）：84-88.

［8］遲曉星，陳容，張麗媛.金雀異黃素對青年雌性大鼠血清性激素水平的影響［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2013，25（2）：36-38.

［9］李廣君，王慧，王樹迎，等.濟寧青山羊發(fā)情周期不同階段LHR在輸卵管的分布及其mRNA表達［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（15）：3235-3245.

［10］Elizabeth A，Aaron M，Hsueh J W.Initial and cyclic recruit-mentofovarianfollicles［J］.EndocrRev，2000，21：200-214.

Genetic Quantitative Research of FSHR and LHR in Ovary and Oviduct of Hy-line Brown Laying Hens

He Jing1，Geng Rende2，Ji Hong3，Ma Li3，Zhang Hongliang3，Kong Fanzhi3，Cheng Xiaoxu3，Yang Huanmin3
（1.Institute of Animal Health Supervision，Harbin Urban Administration of Land Reclamation Bureau in Heilongjiang Province，Harbin 150036；2.The Sixth District of Qindeli Farm of Jiansanjiang Land Reclamation Bureau，Heilongjiang Land Reclamation Bureau；3.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

In order to study the expression level of FSHR and LHR in ovary，the tubal uterine department and fallopian tube funnel department，ovary，tubal uterine department and fallopian tube funnel department were obtained from Hy-line brown laying hens，and the total RNA was extracted.FSHR and LHR target genes were amplificatied by using qRT-PCR，and the amount of FSHR and LHR were detected by fluorescent quantitative PCR.The results showed that FSHR mRNA expression level in ovarian tissue was extremely significantly higher than in the tubal uterine department and fallopian tube funnel department（P＜0.01），and FSHR mRNA expression level in the tubal uterine department and fallopian tube funnel department had no significant difference.LHR mRNA expression level in tubal uterine department was extremely significantly higher than in ovary and fallopian tube funnel department（P＜0.01），and LHR mRNA expression level in ovary and fallopian tube funnel department had no significant difference.The study illustrated the expression of FSHR and LHR in ovary，tubal uterine department and fallopian tube funnel department，which provided the foundation for the study on reproductive physiology of poultry.

hens；FSHR；LHR；gene expression level；fluorescence quantitative

S879.3

A

1002-2090（2015）02-0027-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2015.02.007

2014-08-15

何晶（1965-），女，高級獸醫(yī)師，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事禽類生殖生理學(xué)方面的研究工作。

楊煥民，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：yanghuanmin@aliyun.com。