賀繼剛(綜述),王　平,李洪榮(審校)

(云南省第一人民醫(yī)院心臟大血管外科，昆明 650000)

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外排體的研究概況

賀繼剛(綜述),王平※,李洪榮(審校)

(云南省第一人民醫(yī)院心臟大血管外科，昆明 650000)

摘要：近年來，多項研究表明外排體(Exosome)是從細胞上產(chǎn)生的鱗片狀脫落的囊泡，具有胞外酶的活性。最初認為它僅僅起到一種“垃圾袋”的作用，允許細胞丟掉不需要的蛋白。當內(nèi)涵體和細胞膜相互融合并且釋放Exosome進入細胞間隔。這些囊泡體從細胞內(nèi)釋放出來，它們就被認為是Exosome?，F(xiàn)證實它來源于細胞后期內(nèi)涵體，并且可以在造血干細胞和上皮細胞的培養(yǎng)基中檢測到。Exosome具有多種生物學功能，它可以使得細胞在不需要直接接觸下完成細胞間生物信號轉(zhuǎn)導，其在細胞保護、免疫、疾病診斷等方面成為目前研究的熱點。

關鍵詞：外排體；細胞保護；免疫；疾病診斷

外排體(Exosome)是小的膜性囊泡，從20世紀90年代起受到極大關注[1-2]。此詞于1981年首先提出，是從細胞上產(chǎn)生的鱗片狀脫落的囊泡，具有胞外酶的活性[3]。Exosome所含的蛋白及脂質(zhì)可能是其生物學功能主要部分。Exosome是由專業(yè)的抗原呈遞細胞(即B型淋巴細胞及樹突細胞)所分泌的，它富含組織相容性Ⅰ類及Ⅱ類復合體、共刺激分子及熱激蛋白(heat shock protein,HSP)70～90伴隨分子，因此它可以調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫功能。作為細胞分泌的一種特殊囊泡，它能夠使細胞間得以交流。在最近5年內(nèi)，有超過1500篇有關“Exosome”的文章可以在Pubmed上被檢索到，而且囊泡協(xié)會有超過700個單位加入[4]?，F(xiàn)對Exosome的定義、分離、生物學特征等最新進展予以綜述。

1Exosome的分離

目前對Exosome的分離包括超速離心[5]及超濾。而應用最廣泛的是根據(jù)樣本濃度采用的超速離心。首先通過低速離心去除細胞，而后再以100 000×g～110 000×g的速度離心，獲得Exosome。許多研究人員亦使用蔗糖離心法分離Exosome，由于Exosome溶解于蔗糖的密度為1.13～1.19 kg/L[6]。Cheruvanky等[7]報道，使用超濾純化Exosome比超速離心花費時間少，而且不需要特殊設備。目前的Bioo Scientific試劑盒可以移除血小板、細胞碎片及細胞而后純化Exosome。而System Biosciences的ExoQuick能夠加入到血清、細胞培養(yǎng)基及尿液中沉淀Exosome[7]。雖然這一過程是非常快而且直接，但無法避免的是對Exosome仍缺乏特異性，而且對來自血清中的顆粒很難重新濾去。

2Exosome的檢測

Exosome的電子顯微鏡結構為直徑≤130 nm。雙層脂質(zhì)結構，厚度大約為5 nm，由于Exosome 從內(nèi)涵體(200～500 nm)以“出芽”方式形成，固它們最大直徑為100 nm[5]。所有的Exosome 都包括膜轉(zhuǎn)運體、溶質(zhì)蛋白(GTpase)、四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD8、CDS2)、HSP70、HSP 90、囊泡生成蛋白、磷脂相關蛋白及磷脂[8-9]。生理學上Exosome與胞質(zhì)小體相似，為脂質(zhì)雙層富含磷脂酰絲氨酸、神經(jīng)酰胺和鞘磷脂[10-11]。而跨膜蛋白包括4個區(qū)的跨膜蛋白。而CD9、CD61、CD82能夠表達在Exosome 上，它們可以作為一個穩(wěn)定的標志性分子識別Exosome[12-15]。 此外，也有與Exosome相關的免疫分子，如主要組織相容性抗原[16]、T細胞共受體CD86[17]。對提純的Exosome 可以采用HansaBiomed進行檢測，其提供了一系列的產(chǎn)品統(tǒng)稱為ExoTest試劑盒，可以用于檢驗CD63、CD81或CD9抗體[16]。

由于Exosome除包括蛋白質(zhì)亦包括著RNA。許多文獻指出Exosome所 “轉(zhuǎn)運” 的RNA不同于母體細胞，即Exosome所含某種RNA通過裂解母體細胞無法檢測到[18-20]。由于許多腫瘤學家發(fā)現(xiàn)，原始癌細胞所含特殊微RNA(microRNA，miRNA)存在于循環(huán)Exosome中，因而可將Exosome作為腫瘤檢測的標志分子[21-22]。

3Exosome的生物學特征

3.1Exosome基本生物學作用對于許多細胞而言，Exosome更像是一種細胞分泌或代謝的產(chǎn)物，它可以為細胞扔掉不需要的蛋白及RNA，Exosome的釋放取代了裂解過程對于細胞是有利的，細胞并不需要高效的降解能力或者諸如像腎臟的那樣排泄管道[23]。

3.2Exosome免疫學作用目前，對于Exosome調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的能力進行了大量研究。當細胞暴露于一種應激條件下，它能夠通過釋放7×103的HSP72調(diào)解內(nèi)在免疫系統(tǒng)[24-25]。而最新的研究表明，當暴露于應激條件下能夠改變與免疫有關的miRNA，但目前還不清楚應激誘導下的HSP72和miRNA是怎樣釋放到循環(huán)中的，它們是怎樣和內(nèi)源性免疫細胞相作用的[24]。各種研究也證實，在Exosome上有HSP72和miRNA的出現(xiàn)[25]。Beninson和Fleshner[26]認為：①Exosome可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)；②Exosome易受環(huán)境應激的影響；③暴露于應激下首先激活內(nèi)源性免疫系統(tǒng)及與Exosome相關的應激敏感性蛋白及miRNA，預計應激可以改變Exosome的組成，從而調(diào)節(jié)組織的免疫。在Exosome中富含的miRNA可以通過和信使RNA(mRNA)的5′末端相連接阻止目標基因的表達，miRNA不是通過和mRNA互補以阻止轉(zhuǎn)錄。因此，一條miRNA能夠和數(shù)條mRNA相互作用，而阻止蛋白的表達。

目標miRNA進入內(nèi)涵體的機制還沒有被完全理解，當“母體”細胞暴露于各種應激條件下，其Exosome內(nèi)的miRNA都可能會發(fā)生改變。最近的研究表明，Exosome內(nèi)的miRNA并不是隨機選擇的，而是環(huán)境選擇的結果[27]。因此，與誘導mRNA靜默復合體相關的miRNA可以通過Argonant蛋白、HSP90進入Exosome[27]。

3.3Exosome免疫分子表達Exosome可以表達表面黏附分子，而被受體細胞捕獲。例如，由樹突狀細胞釋放的Exosome含有細胞黏附分子1，并且能夠和它們的配體、位于淋巴細胞及白細胞表面的淋巴細胞功能相關抗原1相配[26]。此外，由網(wǎng)織紅細胞[27]、樹突細胞[11]及T細胞[23]分泌的Exosome可以表達β1和β2整合素，它允許Exosome與細胞表達的細胞間黏附分子1或纖維連接蛋白相匹配，一旦和受體細胞相作用，Exosome就可以將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)[28]，或是通過表面受體激活細胞[13]。

3.4Exosome免疫作用的途徑由抗原呈遞細胞分泌的Exosome 可以通過表面表達的補體抑制蛋白CD55和CD59抑制補體介導的裂解[16-17]。這樣通過Exosome可以對分泌的蛋白、miRNA進行保護，不被降解，其所載蛋白及miRNA可以通過黏膜屏障或細胞間環(huán)境，形成細胞間的遠距離交流并且不需要細胞與細胞的直接接觸。

從B細胞及樹突狀細胞分泌的Exosome富含組織相容性抗原[29]和T細胞共刺激分子[17]。目前研究證實，Exosome通過許多機制促進內(nèi)源性免疫。例如，來源于病原體感染的真核細胞產(chǎn)生的Exosome展示了各種促炎功能，被巨細胞病毒感染的巨噬細胞所分泌的Exosome可以通過其表達的脂體與未感染的巨噬細胞Toll樣受體相匹配，通過激活核因子κB途徑刺激轉(zhuǎn)錄和前炎性細胞因子腫瘤壞死因子α的分泌[29]。Exosome表達高水平的HSP70是一個應激激活蛋白，這一研究也對在應激狀態(tài)下的Exosome檢驗提供了支持。

Exosome通過miRNA調(diào)控內(nèi)源性免疫。受脂多糖影響的巨噬細胞可以上調(diào)細胞間miR-155及下調(diào)miR-125并且通過B細胞κ 輕肽基因增強子核因子抑制因子ε和腫瘤壞死因子α激活增強免疫[26]。其他的與Exosome相關的miRNA也能夠通過Toll樣受體介導炎癥反應[24]，增加前體炎性因子的表達[30]和巨噬細胞分化[31]?；谶@些發(fā)現(xiàn)可以認為，Exosome中的各種miRNA是機體處于應激期檢測免疫功能的理想指標。

3.5Exosome的應激保護作用在應激情況下，身體中主要的軸被激活：下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經(jīng)軸。在應激情況下，應激相關分子的分泌對于調(diào)節(jié)內(nèi)源性免疫是關鍵，組織受損或暴露于病原體時應激相關分子被認為是一個預警信號并可以促使組織存活。例如應激相關分子可進入受損組織[32-33]，在應激相關分子中含有HSP特別是HSP72，當暴露于各種受損因子時，其可以促進前炎性因子生成，并且表達于Exosome上，這使得HSP72成為在應激時檢測Exosome最佳指標。例如在沒有疾病情況下，某些應激如大鼠尾部受損[25]，加熱、剪切[34],這些均不能導致HSP72的上升。此外，HSP72可以誘導巨噬細胞中的一氧化氮合酶，因此可以增強它們的殺菌活性。在這種情況下HSP72扮演著促炎反應因子的角色。許多研究表明，HSP72在Exosome上密集表達，在應激反應下Exosome大量表達，說明在應激反應下基于Exosome 增強的免疫可能為一種關鍵成分，即可以增強免疫[2,26,35]。這些研究也展示了當暴露于應激下，循環(huán)中的Exosome 可以發(fā)生改變。

研究亦表明，在應激情況下通過修飾血漿中Exosome上的HSP72能夠激活Toll樣受體通過抑制miR-142-5P可以上調(diào)gp130基因表達，并且抑制socs3活性并下調(diào)miR-203激活MyD88[36]。與應激相關的Exosome的HSP72和miR-142-5p可能涉及去甲腎上腺素，可以激活α1-ADR。活化后α1-ADR可以啟動G蛋白偶聯(lián)受體從而激活細胞磷脂酶C[36]。

總之，Exosome是重要的炎性介質(zhì)，它們在應激狀態(tài)下的作用與免疫功能密切相關。在各種疾病和體外環(huán)境下它們的組成、功能均會發(fā)生改變。

3.6Exosome的缺血/再灌注損傷的保護Exosome不但有免疫調(diào)節(jié)作用還有減輕心肌缺血/再灌注損傷的效果。Timmers等[37]報道，為了更好地理解Exosome的心肌保護作用，他們將間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)培養(yǎng)基采用濾膜將其內(nèi)部成分系統(tǒng)性的分為各個等級大小，表明具有心肌保護成分為>1000 kPa。即心肌保護是由直徑為50～100 nm的囊泡所介導的[37]。MSCs營養(yǎng)改善心肌缺血已有大量研究，據(jù)Tang等[38]報道MSCs進入缺血心臟，可以減少組織反應，增加血管生成及減少細胞的凋亡，相比用MSCs轉(zhuǎn)分化，其旁分泌可以更好地解釋這些效果。迄今為止，總是將MSCs的旁分泌局限于細胞因子、化學因子及介導于細胞間信號的生長因子。而Exosome的出現(xiàn)從根本上改變了當前對MSCs旁分泌的理解。據(jù)Chen等[39]報道，MSCs分泌的Exosome可以改善缺血/再灌注損傷，其在狹小心肌修復窗內(nèi)，通過在細胞間快速傳遞功能性蛋白和miRNA而啟動細胞修復。Exosome含有的miRNA主要為一些前體形式。推測在心肌保護中Exosome的介入可能代表著其發(fā)揮著重要的組織修復功能，也有可能不同的細胞其分泌出不同的Exosome，而修復不同的組織。

4Exosome的診斷

Mitchell 等[40]報道血清中miR-141是由前列腺癌細胞所產(chǎn)生，依靠其可以從健康人群中篩查出前列腺癌的患者。該研究證實循環(huán)中的Exosome內(nèi)含有miR-141，依靠Exosome可以從健康人群中篩查出前列腺癌的患者。

而Gilad等[41]報道，懷孕婦女血清內(nèi)有已胎盤相關的miRNA(miR-526a，miR-52)，miR-515-5p、miR-521在懷孕期間水平有明顯提高，而它們的水平與懷孕階段有明顯關聯(lián)性，在懷孕期間可以出現(xiàn)在循環(huán)內(nèi)的Exosome中，從而可以明確懷孕。

5Exosome的臨床應用

進入2000年以來有許多Exosome有關的Ⅰ期臨床試驗。①法國使用來源于異體樹突狀細胞分泌的Exosome為疫苗治療遠處轉(zhuǎn)移的淋巴瘤患者[42]。②英國使用Exosome治療非小細胞性肺癌的患者。根據(jù)報道樹突狀細胞細胞分泌的Exosome 大規(guī)模生產(chǎn)是可行的，在臨床試驗中其治療具有很好的耐受性[43]。③中國使用異體腹水來源的Exosome結合集落刺激因子治療結腸癌起到了良好的效果[44]。

6結語

大多數(shù)研究已證實Exosome是從細胞上產(chǎn)生的鱗片狀脫落的囊泡，具有多種生物學功能，它可以使得細胞在不需要直接接觸下完成細胞間生物信號轉(zhuǎn)導，其在細胞保護、免疫、疾病診斷等方面具有明顯作用，但具體的作用機制尚不明確。Exosome是通過何種途徑對免疫細胞或免疫反應通路產(chǎn)生影響的具體機制值得進一步探究，進一步明確Exosome的作用機制能為免疫治療提供新的作用靶點，也能為Exosome臨床應用提供較好的理論基礎。

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Research Surgery of ExosomeHEJi-gang,WANGPing,LIHong-rong. (DepartmentofCardiacVascularSurgery,YunnanFirstPeople′sHospital,Kunming650000,China)

Abstract:In recent years,several studies have shown that exosome is vesicle shed from the cell with the extracellular enzyme activity. It was initially believed to play a "garbage bags" effect,allowing the cells to lose unwanted proteins.When endosomes and the cell membrane merge and release vesicles into the cell interval.These vesicles released from the cells are considered exosome. Now it is confirmed to have derived from late endosomes,and can be detected in hematopoietic stem cells and epithelial cells in culture medium.Exosome has a variety of biological functions, it can make the cell to complete the biological signal transduction between cells without direct contact,and it has become a hot research in cell protection,immunization,and disease diagnosis.

Key words:Exosome; Cell protection; Immunity; Disease diagnosis

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-02-27編輯：相丹峰

基金項目：國家自然科學基金(81460073)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.006

中圖分類號:R379.9

文獻標識碼:A

文章編號：1006-2084(2015)18-3280-04