孔　迪，殷香宇，申龍健(綜述)，王建秀(審校)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，哈爾濱 150001)

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阿爾茨海默病的細胞及基因療法研究現(xiàn)狀

孔迪△，殷香宇，申龍健(綜述)，王建秀※(審校)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，哈爾濱 150001)

摘要：阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)退行性疾病,盡管過去對AD治療的研究有了長足的進步，但是仍然缺乏長期有效的治療辦法。目前，藥物治療和外科手術(shù)治療僅起到緩解AD癥狀的作用，仍不能阻止病情的發(fā)展或者恢復(fù)受損的神經(jīng)功能。而細胞替代療法和基因療法治療AD成為可能，并逐漸成為AD治療的研究熱點，同時也為AD的治療帶來了新的希望。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默?。簧窠?jīng)干細胞；間充質(zhì)干細胞；基因治療

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是以進行性認知功能障礙和行為損害為主要特征的神經(jīng)退行性疾病。起病緩慢進行性發(fā)展，預(yù)后差。其發(fā)病率隨年齡增長而上升，據(jù)統(tǒng)計美國超過65歲的人群AD發(fā)病率占10%，超過85歲人群中占50%[1]。研究顯示，成體的某些腦組織如側(cè)腦室壁的室管膜下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下帶的神經(jīng)上皮干細胞蛋白表達陽性，表明存在神經(jīng)再生現(xiàn)象[2]，而成體內(nèi)源性干細胞數(shù)量較少，不足以修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能。因此,替代丟失及損傷的神經(jīng)元以恢復(fù)其功能，進而延緩病程進展是治療這類疾病的新思路?，F(xiàn)對AD的細胞及基因療法研究現(xiàn)狀予以綜述。

1AD的發(fā)病機制

β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein, Aβ)是老年斑的主要成分，神經(jīng)細胞外Aβ的異常沉積是AD的主要病理學(xué)特征之一[3]。Aβ是其前體淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)分解而成的一個肽段。APP是神經(jīng)元產(chǎn)生的正常蛋白，起促進和支持神經(jīng)細胞生長作用。正常情況下的Aβ產(chǎn)生和降解是平衡的，AD產(chǎn)生的多種因素造成了Aβ的異常沉積。相關(guān)研究采用顯微學(xué)方法觀察了Aβ的不同聚集形態(tài)，探討了其與AD發(fā)病機制的關(guān)系[4]。其毒性機制為：Aβ和其他蛋白形成Aβ纖維，導(dǎo)致細胞外自由基出現(xiàn)，引起神經(jīng)元細胞膜通透性增加，大量Ca2+涌入細胞內(nèi)，依次激活鈣依賴性激酶、蛋白酶、脂肪酶，細胞內(nèi)自由基生成，從而導(dǎo)致細胞損傷乃至死亡[5]。AD的第二特征蛋白Tau蛋白是一種微管蛋白，起維持微管穩(wěn)定性的作用[6]。神經(jīng)元纖維纏結(jié)主要與Tau蛋白異常高度磷酸化有關(guān)。高度磷酸化的Tau蛋白自發(fā)凝聚成雙股螺旋絲導(dǎo)致神經(jīng)元纖維纏結(jié)形成，同時微管的扭曲變性使其不能正常輸送營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)元末端的樹突和軸突發(fā)生營養(yǎng)不良性萎縮[7-8]。到目前為止，AD確切的發(fā)病機制尚不清楚，存在膽堿能受損、神經(jīng)細胞鈣平衡失調(diào)、炎性損傷等多種假說。

2AD的非藥物治療

目前，AD的藥物治療有15大類，主要有膽堿酯酶抑制劑和門冬氨酸受體拮抗劑等，但沒有任何一種藥物能治愈AD。近年來，很多學(xué)者投入到改善癥狀或減慢神經(jīng)病理學(xué)進展的非藥物治療方法的研究中[9-11]。其中，細胞替代療法和基因療法的出現(xiàn)為AD的治療提供了新的思路。

2.1干細胞移植療法

2.1.1胚胎干細胞移植療法當受精卵分裂發(fā)育成囊胚時，將內(nèi)細胞團分離出來進行培養(yǎng)，即可得到胚胎干細胞[12]。有針對性地誘導(dǎo)胚胎干細胞定向分化成不同種類的細胞，如神經(jīng)干細胞(neural stem cell,NSC)、骨髓間充質(zhì)細胞(mesenchymal stem cel1s,MSC)或其他種類的細胞，這些細胞可用于細胞替代療法。然而胚胎干細胞移植后易產(chǎn)生非轉(zhuǎn)移性良性畸胎瘤甚至免疫反應(yīng)[9]，而且這種分化無序、不受約束甚至面臨倫理學(xué)的束縛，試驗研究難以展開。

2.1.2NSCNSC可來源于胚胎干細胞和成年干細胞。前者需從胚胎獲取干細胞，因而面臨倫理學(xué)的束縛。對于未來臨床應(yīng)用，成年來源的NSC更具可行性。成年來源的NSC包括存在于成年神經(jīng)組織中的干細胞和從其他組織中分化得到的干細胞。NSC被稱之為能自我增殖的多能干細胞，可以分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞[10]。NSC首先在成年大鼠室管膜下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下帶被發(fā)現(xiàn)。NSC分化成神經(jīng)細胞并從室管膜下區(qū)遷移到嗅球，在這里形成成熟神經(jīng)元并參與嗅覺的形成。海馬齒狀回顆粒下帶的NSC遷移并分化成海馬區(qū)的神經(jīng)元，這就意味著海馬齒狀回顆粒下帶的神經(jīng)再生對于記憶力至關(guān)重要[11]。AD患者存在記憶力下降及氣味辨別缺陷的癥狀，表明病理學(xué)的進展可能影響到神經(jīng)元的再生。以上病理改變也為細胞移植的可行性提供了理論依據(jù)，即將體外擴增的NSC移植到腦內(nèi)，以替代丟失、受損的神經(jīng)元，從而修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的功能。NSC移植治療AD的可能機制如下：NSC能分化成臨床所需神經(jīng)樣細胞、分泌營養(yǎng)因子、促進內(nèi)源性修復(fù)、刺激血管再生、作用于炎性細胞[13]。

很多研究已成功將干細胞療法[14]應(yīng)用到治療AD。Qu等[15]的研究顯示，將NSC移植入有記憶力損傷的成年AD鼠的側(cè)腦室，結(jié)果AD大鼠的認知功能得到明顯改善。同時證明，移植入腦內(nèi)的NSC已經(jīng)成功分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)，并遷移到不同的大腦區(qū)域。Blurton-jones等[16]研究闡明移植NSC需要一些因子參與。將NSC移植入成年三重轉(zhuǎn)基因小鼠海馬，成功地改善了它們的空間學(xué)習及記憶能力。除此之外他們還發(fā)現(xiàn)在突觸集中區(qū)域有高水平的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達，表明在NSC移植中，NSC分泌的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對于認知功能的改善至關(guān)重要。研究表明，NSC移植聯(lián)合轉(zhuǎn)基因加上持續(xù)的營養(yǎng)因子支持具有成功治療AD的可能性[17]。通常認為AD患者出現(xiàn)癡呆及記憶損害的表現(xiàn)主要與腦基底核部位的損傷有關(guān)，該部位存在膽堿能神經(jīng)元。將一種源自胎齡14日胎鼠海馬趾原基的永生化NSC系MHP36細胞注入前腦膽堿能損傷的AD模型內(nèi)，發(fā)現(xiàn)外源性干細胞主動遷至損傷區(qū)域，分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，重建錐體細胞層的大體結(jié)構(gòu)，鼠認知功能恢復(fù)。該研究說明外源性MHP36細胞能在損傷部位替代膽堿能神經(jīng)元[18]。

很多動物實驗證實NSC可被成功體外培養(yǎng)，移植后的NSC能存活、分化和遷移[11]。但是AD移植治療存在的最大挑戰(zhàn)就是缺乏自體同源性的干細胞。對于人腦神經(jīng)元能否識別這些細胞，研究者仍存在一些顧慮。而且，AD移植治療需要克服因長期培養(yǎng)神經(jīng)干細胞帶來的轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定分化相關(guān)問題。Wu等[19]在人胚胎NSC體外培養(yǎng)增殖過程中增加了一個新的步驟，能促使其在體內(nèi)微環(huán)境中幾乎完全誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元。將處理后的NSC移植入成年鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其在微環(huán)境誘導(dǎo)下可獲得膽堿能神經(jīng)元表型，使NSC移植治療從單純移植向功能性移植向前邁進了一步。但最關(guān)鍵的問題是怎樣在特定損傷部位定向誘導(dǎo)NSC分化為膽堿能神經(jīng)元。目前，在體外、體內(nèi)對NSC的定向誘導(dǎo)分化尚未得到很好的解決，而且移植到體內(nèi)后能否獲得成熟神經(jīng)元的全部特征，目前也沒有研究定論。另外AD的發(fā)病機制目前尚不完全清楚，它的病理狀態(tài)(如高Aβ)是否會影響外源性NSC的增殖分化，如何避免這種影響，均有待進一步的研究與解決。NSC移植治療從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用還有相當?shù)木嚯x，但確為AD治療開辟了新途徑，應(yīng)用前景深遠。

2.1.3MSCsMSCs是近年來才被確認的非神經(jīng)元成體干細胞。MSCs源于中胚層，易于培養(yǎng)、擴增，具有多向分化潛能，在一定的環(huán)境和條件下可以分化為多種細胞，如成骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、心肌細胞等[10]。MSCs已經(jīng)被證實在體內(nèi)外均可分化成神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞[10]。同時MSCs來源豐富、取材簡便、自體移植避免了倫理問題和免疫原性反應(yīng)，這些特征使其成為細胞替代治療比較理想的方法。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用不同來源的MSCs進行了大量研究并取得一定結(jié)果。Lee等[20]將來源于骨髓MSCs移植入APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬內(nèi)移植導(dǎo)致了內(nèi)源性小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的活化，并觀察到Aβ、過度磷酸化Tau蛋白的減少，小鼠空間學(xué)習能力及記憶力得到改善。人類臍帶血MSCs也已經(jīng)被移植到急性期AD小鼠模型內(nèi)[21]。在雙重轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，這些細胞的植入同樣減少了Aβ及Tau蛋白的沉積，改善了小鼠的空間學(xué)習及記憶力。這些效果與小膠質(zhì)細胞分泌的炎性因子的水平下降有關(guān)。盡管人類臍帶血MSCs移植非常具有前景，但臍帶血間充質(zhì)干細胞缺乏與其他類型MSCs的對比性研究，未來的研究有必要解決這一問題。

2.2基因治療移植前干細胞的基因修飾可以提高細胞的生存率及有效率[22]。如前所述，AD患者的膽堿能神經(jīng)元存在丟失，針對這一問題，有學(xué)者致力于研究能產(chǎn)生乙酰膽堿的基因修飾細胞。原始的成纖維細胞系基因工程表達膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶證明了移植入小鼠海馬后有產(chǎn)生乙酰膽堿的能力[23]。在AD的基因治療中，其應(yīng)用是過度表達Aβ降解酶，從而改善細胞外的淀粉樣蛋白沉積，這已經(jīng)被有關(guān)研究證實[24]。表達Aβ降解酶的轉(zhuǎn)基因小鼠證實了Aβ沉積的減少并且證實了表達Aβ降解酶的轉(zhuǎn)基因MSCs有體外降解Aβ沉積的能力。將轉(zhuǎn)染慢病毒載體Aβ降解酶的原始成纖維細胞移植入轉(zhuǎn)基因小鼠也獲得類似結(jié)果。Wu等[17]的研究證實了表達hNGF的基因改良NSCs能夠融入機體內(nèi)并代替損傷或丟失的神經(jīng)細胞。此外，有研究將載有hNGF基因的成纖維細胞植入8例AD患者前腦中，在第一臨床試驗階段患者認知功能減退發(fā)生率有所改善[25]。由腺病毒增強神經(jīng)生長因子表達的第二臨床試驗階段也正在進行中[26]。

雖然目前基因治療AD仍面臨很多問題，如基因表達的安全性、穩(wěn)定性、有效性等，但隨著對基因表達調(diào)控機制研究的深入及相關(guān)技術(shù)方法的完善，相信基因治療將會成為一種治療AD的新的重要方法。

3小結(jié)

雖然細胞替代療法和基因療法應(yīng)用于臨床仍面臨許多困難，臨床應(yīng)用試驗已在進行，盡管細胞存活率、免疫反應(yīng)及手術(shù)治療的挑戰(zhàn)仍然需要解決，但是近年來取得的研究進展已經(jīng)為AD的治療帶來了新的希望，具有傳統(tǒng)藥物治療和外科手術(shù)治療不可比擬的優(yōu)勢。近年來國內(nèi)外學(xué)者對AD細胞及基因療法也進行了大量的研究，并取得了一定的成果，相信隨著研究的深入，必將為AD的治療帶來更多的希望。

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Research Advances in Cell and Gene Therapy for Alzheimer DiseaseKONGDi,YINXiang-yu,SHENLong-jian,WANGJian-xiu. (DepartmentofInternalNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Abstract：Alzheimer disease(AD) is a neurodegenerative disease. Although the treatment of AD has made great progress, there is still no long-term effective treatment for this disease.At present,drug therapy and surgery can only alleviate the symptoms of AD,which cannot halt the progression or restore the damaged neural function.And the stem cell treatment and gene-modified therapy have become technically feasible, and gradually become a focus in the therapeutic strategies for AD,which has brought hope for the treatment of AD.

Key words:Alzheimer disease; Neural stem cell; Mesenchymal stem cell; Gene therapy

收稿日期：2014-12-08修回日期：2015-03-05編輯：相丹峰

基金項目：黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(2009-067)；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院院基金(2009B16)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.013

中圖分類號:R741.05

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)18-3299-03