顧鳳鳴　李清華　劉開祥　郭豐寧　陳梅玲　曾愛源

摘要：目的：探討HSP70敲低（HSP70RNAi）在阿爾茨海默病（AD）發(fā)病機(jī)制中的作用。方法：利用經(jīng)典的GAL4/UAS系統(tǒng)，選用ninaE-GAL4啟動子，將突變位點(diǎn)在R406W處的Tau蛋白在果蠅復(fù)眼內(nèi)選擇性表達(dá)，構(gòu)建ninaE-GAL4/UAS系統(tǒng)AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型。然后觀察在敲低和不敲低分子伴侶HSP70表達(dá)的情況下，HSP70在AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型中的作用。結(jié)果：HSP70RNAi明顯抑制了AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型的復(fù)眼視網(wǎng)膜光感受神經(jīng)元變性。結(jié)論：HsP70RNAi對AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型具有神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默??；Tau；HSP70；果蠅

中圖分類號：Q969.462.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008—2409（2015）04—0001—04

AD是一種年齡相關(guān)的、不斷進(jìn)展的神經(jīng)退行性突病，以記憶障礙和多重認(rèn)知損害為特征。隨著人類壽命的增長，AD可能成為人類健康的焦點(diǎn)，給個人及家庭帶來了負(fù)擔(dān)。AD患者大腦的組織病理學(xué)研究表明，突觸丟失、線粒體異常和炎性反應(yīng)是其特征性表現(xiàn)，除此之外還有分布在大腦學(xué)習(xí)和記憶區(qū)的細(xì)胞外的淀粉樣（AB）蛋白及細(xì)胞內(nèi)TAU蛋白過度磷酸化所致的神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFTs）。過度磷酸化的TAU蛋白在AD中更容易聚集，因此，降低這些TAU蛋白的水平成為治療AD的有期望的途徑。TAU蛋白的穩(wěn)態(tài)通常是由分子伴侶來調(diào)控，如熱休克蛋白70。因其調(diào)節(jié)TAU蛋白穩(wěn)態(tài)方面潛在的治療作用，HSP70引起了越來越多研究者的重視。細(xì)胞模型中，HSPT0的ATP酶活性抑制劑可以促進(jìn)TAU蛋白的逆轉(zhuǎn)和恢復(fù)它的穩(wěn)定。第一代HSP70抑制劑，如亞甲藍(lán)（MB），能提高TAU蛋白病小鼠模型的學(xué)習(xí)和記憶能力。本研究探討HSP70RNAi對AD的作用，采用遺傳干預(yù)使HSP70RNAi在ninaE-GAIA/UAS系統(tǒng)的AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型視網(wǎng)膜光感受神經(jīng)元中表達(dá)，觀察HSP70RNAi對AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型是否具有保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1材料

果蠅品系：w1118、ninaE-GAL4購自美國Bloomington果蠅中心；模型UAS-hTauR406W購自美國哈佛大學(xué)；雙平衡系果蠅sco/CyO；TM3/TM6由中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈；HSP70RNAi由清華大學(xué)惠贈。

1.2方法

1.2.1果蠅雜交

1.2.1.1構(gòu)建w1118/+；ninaE-GALA/+的果蠅

將w1118的處女蠅與ninaE-GAIA的雄性果蠅雜交，收取F1代，即基因型為wlll8/+；ninaE-GAIA/+的目的果蠅。即正常對照果蠅。

1.2.1.2構(gòu)建ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/+的果蠅將ninaE-GAIA處女蠅與UAS-hTauR406W雄性果蠅雜交即得到ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/+果蠅。

1.2.1.3構(gòu)建HSP70RNAi對AD轉(zhuǎn)基因模型干預(yù)的果蠅將ninaE-GAIA處女蠅與sco/CyO；TM3/TM6雄性果蠅雜交，構(gòu)建基因型為ninaE-GAL4/sco；+/TM3的果蠅；同時將UAS-hTauR406W處女蠅與sco/CyO；TM3/TM6雄性果蠅雜交，構(gòu)建基因型為+/CyO；UAS-hTauR406W/TM6的果蠅；再將ninaE-GAIA/sco；+/TM3的處女蠅與+/CyO；UAS-hTauR406W/TM6雄性果蠅雜交，篩選卷翅且短剛毛的子代，即基因型為ninaE-GAIA/CyO；UAS-hTauR406W/TM3的目的果蠅。再將HSP70RNAi的處女蠅與ninaE-GAIA/CyO；UAS-hTauR406W/TM3的雄性果蠅雜交，篩選基因型為ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi的目的果蠅。即ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi的果蠅。

1.2.2數(shù)據(jù)采集

1.2.2.1觀察果蠅復(fù)眼形態(tài)并拍照 用奧林巴斯體視顯微鏡觀察第7天的雄性目的果蠅復(fù)眼結(jié)構(gòu)。

1.2.2.2應(yīng)用試劑盒檢測線粒體三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）濃度取第7天的w1118/+；ninaE-GAL4/+果蠅（正常對照組），ninaE-GAL4/+；UAS-hTauR406W/+果蠅（疾病模組），ninaE-GAL4/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi果蠅（基因干預(yù)組）各10只雄性果蠅，切取果蠅頭部；分別將果蠅加入0.1 LATP反應(yīng)液中進(jìn)行研磨，充分反應(yīng)后調(diào)離心機(jī)轉(zhuǎn)速為10 000 r/min離心15 min，分別取出0.01 L上清液加入96孔板后，再分別加入0.09 LATP反應(yīng)液；將標(biāo)準(zhǔn)品按一定的濃度梯度稀釋，并加入96孔板；室溫避光反應(yīng)15 min后，酶標(biāo)儀測定OD值；減去本底發(fā)光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ATP濃度，計(jì)算ATP濃度與正常對照組的百分比。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型

為鑒定AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型，本研究分別從果蠅表型、果蠅ATP分析比較正常對照組與AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型。結(jié)果顯示。AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型復(fù)眼表面粗糙凹凸不平，面積較正常果蠅明顯減小，色素沉著減少。詳見圖1。AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型與正常對照組相比較，其ATP明顯降低，t=10.544 P<0.01。詳見圖2。

2.2 HSP70RNAi對AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型的影響

為了探討HSP70RNAi對AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型是否有保護(hù)作用，本研究從果蠅表型、果蠅ATP分析HSP70RNAi對AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型的影響。結(jié)果顯示HSP70RNAi對疾病模型干預(yù)后，果蠅復(fù)眼較疾病組呈現(xiàn)明顯的好轉(zhuǎn)，復(fù)眼表面光整，復(fù)眼面積稍增大，色素沉著加深。詳見圖3。ATP水平升高，t=-6.653，P<0.01。詳見圖4。

3討論

神經(jīng)元內(nèi)異常的TAU蛋白在AD的神經(jīng)變性進(jìn)程中起到了重要的作用。TAU是微管相關(guān)蛋白，可幫助調(diào)節(jié)神經(jīng)元微管的穩(wěn)定性。當(dāng)TAU蛋白被異常的過度磷酸化，微管與TAU結(jié)合減少使微管不穩(wěn)定，影響軸突運(yùn)輸，導(dǎo)致NTFs聚集。一些研究表明減少TAU蛋白可能有益，而另一些研究表明TAU蛋白的完全丟失有毒性作用。TAU敲除的老鼠在特定的遺傳背景下表現(xiàn)正常。但是人類的MAPT（micro-tubule associated protein））基因刪除表現(xiàn)出嚴(yán)重的智力低下。這表明在不同的研究背景下，TAU蛋白的量不同，有可能造成截然不同的結(jié)果。人類TAU蛋白突變頻率最高的位點(diǎn)是R406W，將人類的R406W突變位點(diǎn)轉(zhuǎn)入果蠅，運(yùn)用ninaE-GAL4啟動子，使R406W在果蠅復(fù)眼特異性表達(dá)，建立了AD模型。

HSP70似乎能從本質(zhì)上區(qū)分功能型TAU、與微管結(jié)合的TAU和異常的游離TAU。所有的HSP70變體可以識別游離TAU是因?yàn)樗慕Y(jié)合位點(diǎn)位于微管結(jié)合域。因而當(dāng)TAU和微管結(jié)合，它就和HSP70分離。同時，改變TAU和微管關(guān)系的磷酸化位點(diǎn)已被證明影響它與分子伴侶之間的相互作用。尸檢AD患者大腦皮層發(fā)現(xiàn)HSP70蛋白水平增高，證明HSP70與大腦的患病區(qū)域關(guān)系密切。

研究顯示，多種神經(jīng)退行性疾病存在能量代謝障礙，在阿爾茨海默病和遺傳性脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)退行性疾病中，均發(fā)現(xiàn)存在能量代謝障礙。蛋白降解是一個耗能過程，ATP的生成減少必然影響到蛋白降解效率。研究表明透過血腦屏障的HSP70抑制劑，可以降低人工培育腦組織TAU蛋白水平。細(xì)胞模型中抑制HSPT0活性，導(dǎo)致快速的依賴蛋白酶體的TAU降解，降低了TAU水平。由此可見，HSP70與TAU的降解密切相關(guān)。為明確HSP70RNAi對AD疾病是否具有神經(jīng)保護(hù)作用，筆者在ninaE-GAIA/UAS系統(tǒng)AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型的光感受神經(jīng)元中干擾HSP70表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSP70RNAi干預(yù)AD轉(zhuǎn)基因果蠅模型ninaE-GAL4/+：UAS-hTauR406W/+后，與疾病模型組比較，ninaE-GALA/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi果蠅復(fù)眼表面結(jié)構(gòu)較光整，復(fù)眼面積稍增大，色素沉著加深，且ATP水平增高。

本研究表明HSP70RNAi可以抑制AD轉(zhuǎn)基因果蠅神經(jīng)變性，HSP70RNAi對AD轉(zhuǎn)基因果蠅具有神經(jīng)保護(hù)作用。但它的具體保護(hù)機(jī)制卻仍未可知。近年來，關(guān)于分子伴侶HSPT0的研究越來越多，除AD外，HSP70還與SCA3/MJD的毒性蛋白ataxin-3有關(guān)聯(lián)。這些研究表明HSP70在神經(jīng)退行性疾病中起到舉足輕重的作用。除作為分子伴侶外，HSP70是否還有其他功能？是杏會啟動其他路徑來進(jìn)行蛋白降解？這些都需要進(jìn)一步驗(yàn)證?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)了HSP70RNAi對AD的神經(jīng)保護(hù)作用。這將為今后的基因及藥物治療提供一個很好的方向。