謝琦　劉永明

摘要：目的：從大腸桿菌中選擇性抽提GST-Tal-TP5融合蛋白。方法：采用滲透休克法從大腸桿菌中提取GST-Totl-TP5融合蛋白，優(yōu)化操作條件，并與超聲破碎法進行比較。結(jié)果：優(yōu)化后的滲透休克法從大腸桿菌提取GST-TotI-TP5融合蛋白可使雜蛋白量含量相對超聲破碎法降低一個數(shù)量級。結(jié)論：滲透休克法可高效提取大腸桿菌表達的GST-Tα1-TP5融合蛋白。

關(guān)鍵詞：滲透休克法；大腸桿菌；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶；重組胸腺肽Tα1-TP5

中圖分類號：R441.9；Q51；R378.21 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-2409（2015）04-0009-04

胸腺素α1（Tα1）是胸腺組分5（thvmosin fraction 5）中分離出來的由28個氨基酸殘基組成的多肽，胸腺五肽（TP5）是胸腺生成素Ⅱ第32—36位的氨基酸殘基片段。Tod和TP5均屬免疫調(diào)節(jié)劑，臨床上二者均被用于治療免疫缺陷、肝炎、腫瘤和艾滋病等疾病。為了進一步研究二者的聯(lián)合作用，本實驗構(gòu)建了與GST基因融合表達的重組胸腺肽Tα1-TP5表達菌株，在乳糖的誘導(dǎo)下實現(xiàn)了高效可溶性表達。

滲透休克法可選擇性提取大腸桿菌周質(zhì)空間蛋白，對簡化后期純化工藝十分有利。有文獻報道采用滲透休克法提取重組大腸桿菌周質(zhì)空間的青霉素G酰化酶，回收率92.4%，純化倍數(shù)3.22。目前，大腸桿菌表達的GST融合蛋白大多采用超聲破碎法，該法得到的粗酶液比活較低。本研究探討用滲透休克法從大腸桿菌中提取GST-Tα1-TP5融合蛋白，并優(yōu)化操作條件。

1材料與方法

1.1材料與試劑

大腸桿菌BL21（DE3）[PGEX-4T-1]，攜帶重組胸腺肽Tα1-TP5基因。

BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自上海生物工程公司；

TB培養(yǎng)基：酵母粉2.4%，蛋白胨1.2%，甘油0.4%，磷酸二氫鉀17 mmol/L，磷酸氫二鉀72 mmol/L，高壓滅菌時磷酸鹽與其他組分分開，待溶液冷卻至60%以下后混合。

1.2實驗方法

1.2.1培養(yǎng)條件 500ml三角瓶裝TB培養(yǎng)基100ml，接種量0.5%，37℃，250 r/min，搖床培養(yǎng)，2.5 h后加終濃度1 dL乳糖誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)6h后收集菌體。

1.2.2蛋白質(zhì)含量測定 采用BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定。

1.2.3 GST酶活測定采用分光光度法嘲測定GST-Tcx1-TP5融合蛋白的酶活。

1.2.4超聲破碎細胞 離心收集菌體，20 mM Tris-HCL（pH 8.0）緩沖液洗滌離心，菌體重懸，冰浴超聲破碎10 rain（工作30 s，間歇30 s），破碎后在14 000 r/min下冷凍離心10min，所得上清即為粗酶液。

1.2.5滲透休克法 發(fā)酵液離心去上清液，菌體用PBS洗滌1次后重懸于1/2發(fā)酵液體積的高滲溶液中，于25℃輕柔磁力攪拌30min，4℃12 000 r/min離心10min，棄高滲液，在菌泥中加入1/2發(fā)酵液體積的預(yù)冷的低滲溶液中，于冰浴中輕柔磁力攪拌一定時間，4℃14000 r/min離心10min，得上清液，為粗酶液。1.2.6蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)實驗高滲溶液為100 mM Tris-HCl含10mM EDTA和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%，20%，30%，40%，50%）的蔗糖，pH 9.0；低滲液為20 mMTris-HCL，pH 8.0；低滲提取時間為20min；實驗方法見1.2.1和1.2.5。粗酶液進行12%SDS-PAGE分析。

1.2.7低滲液選擇實驗根據(jù)1.2.6的實驗結(jié)果，高滲液所含蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時，GST-Tα1-TP5融合蛋白的提取率最高，后續(xù)的條件優(yōu)化以此為基礎(chǔ)。

選擇3種不同的低滲液進行比較，分別為水，pH6.9；20 mM Tris-HCl，pH 8.0；20 mM PBS，pH 7.4。實驗方法見1.2.1和1.2.5。粗酶液進行12%SDS-PAGE分析。

1.2.8低滲處理時間實驗 根據(jù)1.2.7的實驗結(jié)果，選擇最優(yōu)的低滲液，后續(xù)的實驗以此為基礎(chǔ)。

低滲提取時間選擇10min，20min，30min，40min，50 min，60 min。實驗方法見1.2.1和1.2.5。粗酶液進行12%SDS-PAGE分析。

1.2.9超聲波法與滲透休克法的比較 將同一批發(fā)酵得到的菌體分別按1.2.4和1.2.5方法提取粗酶液，滲透休克法采用優(yōu)化后的條件。所得粗酶液在同樣條件下進行12%SDS-PAGE，按1.2.2方法測定蛋白質(zhì)含量，按1.2.3法測定GST-Tα1-TP5融合蛋白酶活。

2結(jié)果與分析

2.1蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

滲透休克的操作中，高滲液蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是關(guān)鍵。為了進一步提高提取率，在配制不同蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高滲液時，加入終濃度100 mM Tris-HCl，調(diào)節(jié)高滲液的pH 9.0，同時還添加10mM的EDTA以增加細胞膜的通透性。實驗結(jié)果見圖1。

從SDS-PAGE電泳圖譜分析可知，GST-Tα1-TP5融合蛋白的條帶的強度在蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時最強，該條件下GST-Tα1-TP5融合蛋白的提取率最高。后續(xù)的實驗高滲液蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均采用20%。

2.2低滲液的影響

采用2.1優(yōu)選的高滲液處理后，比較3種低滲液的提取效果。實驗結(jié)果見圖2。根據(jù)SDS-PAGE電泳圖譜，3種低滲液的提取效果為：20 mM Tris-HCl（pH 8.0）略優(yōu)于水（pH 6.9）和20mMPBS（pH7.4）。又由于GST融合蛋白在20mMTris-HCl（pH 8.0）緩沖液中可以更好地保持酶活，利于后續(xù)酶活的測定和利用GST的特性進一步地精制純化目的蛋白，所以本實驗選擇20mM Tris-HCL（pH 8.0）為最優(yōu)的低滲液

2.3低滲處理時間的影響

不同低滲處理時間的結(jié)果見圖3，根據(jù)SDS-PAGE電泳圖譜分析，低滲提取時間選擇10 min時，目的蛋白提取率明顯低于20～60 min的提取率。當(dāng)提取時間達到20 min以后，目的蛋白的提取率變化不大。說明周質(zhì)蛋白從周質(zhì)空間滲出并達到平衡大約需要20min，進一步延長時間，對提高目的蛋白的提取率作用不大，而且還會增加胞質(zhì)蛋白的滲出，對純化不利，所以最優(yōu)的低滲處理時間選擇20 min。

2.4超聲波法與滲透休克法的比較

將同一批發(fā)酵得到的菌體分別按將優(yōu)化后的滲透休克法與常規(guī)的超聲破碎法提取GST-Tα1-TP5融合蛋白，同樣條件下進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖4。同時測定兩種方法提取粗酶液的蛋白含量和酶活，結(jié)果見表1。從電泳圖譜可直觀地看到滲透休克法提取的粗酶液比超聲破碎細胞得到的粗酶液雜蛋白含量少得多。從表1的結(jié)果可知，兩種方法提取的總酶活相差不大，但二者比活相差近10倍。

3討論

大腸桿菌是表達重組蛋白常用的宿主菌，對于表達于大腸桿菌周質(zhì)空間的重組蛋白，最好的抽提方法是在保持細胞內(nèi)膜完整的條件下，選擇性地部分破壞細胞外膜和細胞壁，使蛋白最大限度釋放出來，而胞內(nèi)物質(zhì)盡量不受影響地存在于細胞內(nèi)。本實驗采用的滲透休克法是針對大腸桿菌的特點而設(shè)計的周質(zhì)蛋白定向釋放技術(shù)，大腸桿菌是細胞壁較脆弱的G^-菌，外膜主要組成為脂多糖，脂多糖具有吸附金屬陽離子如Ca²⁺、Mg²⁺等作用。該方法首先將大腸桿菌置于含有EDTA的高滲蔗糖介質(zhì)中，在高滲環(huán)境中細胞內(nèi)水分外流，導(dǎo)致細胞收縮，同時利用EDTA螯合陽離子的能力，螯合吸附在外膜脂多糖表面上的金屬陽離子，使細胞外膜受損，然后將收縮的細胞置入低滲的環(huán)境中，由于滲透壓的急劇變化，細胞形態(tài)發(fā)生變化，細胞吸水膨脹，細胞周質(zhì)空間也急劇膨脹，受損的外膜和細胞壁被部分撐破，通透性增加，周質(zhì)空間的蛋白釋放到胞外。若采用細胞完全破碎的抽提方法，細胞內(nèi)容物全部釋放，大量的雜蛋白與目的蛋白混雜在一起，增加了后續(xù)純化的困難，最終將影響目的蛋白的提取率，此外，大量的雜蛋白中可能含有的蛋白酶或其他的抑制劑，對目的蛋白的提取也有影響。采用激烈的細胞破碎方法，如實驗室常用的超聲破碎法和工業(yè)生產(chǎn)中常用的機械破碎法還會對目的蛋白的活性存在一定的破壞作用，如引起部分目的酶的失活等。

本實驗對在大腸桿菌周質(zhì)空間表達的GST-Tαl-TP5融合蛋白的滲透休克提取法進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的提取條件是高滲液為pH9.0，100mM Tris-HCl含10mM EDTA和20%的蔗糖，低滲液為20 mM Tris-HCl，pH 8.0，低滲提取時間為20 min。采用滲透休克法不需要復(fù)雜的設(shè)備和操作成本，規(guī)?？纱罂尚?，適用范圍廣，不僅為實現(xiàn)重組胸腺肽的大規(guī)模生產(chǎn)提供了新的技術(shù)支撐，對其他表達于細胞周質(zhì)的重組蛋白的提取也起一定的借鑒作用。