張星星 鄧常文 屈玉蘭 白 沖

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間充質(zhì)干細(xì)胞及其在臨床中的應(yīng)用

張星星 鄧常文 屈玉蘭 白 沖

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一類中胚層來(lái)源的干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力的同時(shí)無(wú)明顯的不良反應(yīng)而日益成為研究的熱點(diǎn)。全身或局部器官的免疫失調(diào)是臨床上眾多疾病的發(fā)病機(jī)制，MSC的出現(xiàn)為對(duì)激素抵抗或無(wú)法耐受免疫抑制劑的患者帶來(lái)了新的希望。

間充質(zhì)干細(xì)胞 免疫調(diào)節(jié)能力 臨床應(yīng)用

由于大多種免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，臨床治療仍常以激素和免疫抑制劑為主，而對(duì)激素耐藥或免疫抑制劑無(wú)法耐受很常見，如何更好地治療這些疾病，已成為臨床亟需解決的問題。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是骨髓中一類非造血干細(xì)胞，可以自我更新或分化為骨、軟骨或脂肪組織等多種細(xì)胞。MSC在骨髓中生成基質(zhì)層，是造血微環(huán)境的組成部分，起著支持造血祖細(xì)胞造血的功能。除了最常用的骨髓來(lái)源，MSC還可以從胎盤、脂肪組織、臍帶血及肝中獲得。自從發(fā)現(xiàn)它可以抑制T細(xì)胞的免疫反應(yīng)之后，再加上容易分離、體外易擴(kuò)增且不丟失干細(xì)胞潛能等特性，MSC在臨床上的應(yīng)用逐漸引起關(guān)注，有望成為治愈臨床免疫性疾病的新方法。本文主要討論MSC的免疫學(xué)特性及在各種疾病治療中的研究進(jìn)展。

一、MSC的治療機(jī)制

1.MSC的遷移：在未受干預(yù)的動(dòng)物體內(nèi)，骨髓是MSC優(yōu)先歸巢的器官，但在有炎癥的動(dòng)物體內(nèi)，通過血管注射的MSC會(huì)優(yōu)先歸巢至炎癥存在的部位[1～3]。MSC表面雖然缺乏人P-選擇素糖蛋白配體1，但是仍然可以通過與P-選擇素的互動(dòng)實(shí)現(xiàn)在內(nèi)皮上的滾動(dòng)而MSC表面表達(dá)的CD44和極遲反應(yīng)抗原4通過血管細(xì)胞黏附分子-1黏附在血管內(nèi)皮上；一旦MSC成功黏附在血管內(nèi)皮上，則通過包括結(jié)合黏附分子、鈣黏素和血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子等一系列復(fù)雜的相互作用，使細(xì)胞滲出血管進(jìn)入骨髓間質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)，然后經(jīng)α1整合素和CD44，黏附在透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、膠原蛋白和纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的組成部分上。遷移的方向主要是由趨化分子的濃度梯度決定的。

2.MSC的免疫抑制作用：由于MSC具有免疫抑制的特點(diǎn)，注射MSC已經(jīng)被用在多種臨床試驗(yàn)中，來(lái)治療移植物抗宿主病及多種自身免疫性疾病。

(1)MSC對(duì)固有免疫的影響：MSC表面表達(dá)的因子H和其他多種補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，使MSC能免受機(jī)體介導(dǎo)的急性和超急性排斥反應(yīng)的攻擊，但是MSC仍可以被補(bǔ)體小片段如補(bǔ)體C3a和C5a等招募到組織受損區(qū)域發(fā)揮作用[4]。1)MSC與中性粒細(xì)胞：MSC可以削弱中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)，還可以通過IL-6依賴方式延遲靜息、激活中性粒細(xì)胞的凋亡，以達(dá)到延長(zhǎng)中性粒細(xì)胞壽命的目的，MSC對(duì)中性粒細(xì)胞的保護(hù)功能對(duì)于含有大量具有功能的成熟中性粒細(xì)胞器官，比如骨髓、肺來(lái)說可能具有重要的保護(hù)作用[5]。2)MSC與樹突狀細(xì)胞：樹突狀細(xì)胞(DC)是最重要的抗原遞呈細(xì)胞，是唯一可以激活初始T細(xì)胞抗原遞呈細(xì)胞。人類MSC與DC共培養(yǎng)后，DC分泌TNF-α下降。此外，MSC可抑制DC的表面MHCⅡ類分子和共刺激分子的上調(diào)，MSC還可阻止單核細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞和CD34+造血干細(xì)胞向DC的分化成熟，這表明MSC對(duì)于不同來(lái)源的DC的成熟過程有抑制作用[6～8]。3)MSC 與自然殺傷細(xì)胞：MSC通過下調(diào)自然殺傷(NK)細(xì)胞表面NKp30、和NKG2D的表達(dá)，從而抑制靜息期NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性[9]。人類MSC和NK細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，NK細(xì)胞增殖受到抑制，IFN-γ的分泌顯著減少[9，10]。關(guān)于MSC在與NK細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)是否易于被NK細(xì)胞吞噬仍存在爭(zhēng)議。

(2)MSC對(duì)適應(yīng)性免疫的影響：1)MSC與T細(xì)胞：T淋巴細(xì)胞在受到細(xì)胞來(lái)源或非特異性的有絲分裂原刺激時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生增殖反應(yīng)，MSC可以抑制該增殖過程，且此過程為可逆的，TGF-β1和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可能起到重要作用。MSC可促進(jìn)Th1免疫反應(yīng)向Th2免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)化，其中絕大部分的體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均認(rèn)為MSC可以直接抑制CD3+CD4+T細(xì)胞增殖以及Th1細(xì)胞因子(如IL-2和IFN-γ)的分泌。還有學(xué)者認(rèn)為T細(xì)胞在MSC存在的情況下因?yàn)镸SC表面不表達(dá)共刺激分子作為第2信號(hào)而變?yōu)槊庖邿o(wú)能，當(dāng)然這還有待于進(jìn)一步確定[11]。有些研究顯示MSC對(duì)具有細(xì)胞毒性的T細(xì)胞有直接抑制作用。在細(xì)胞毒性T細(xì)胞的啟動(dòng)階段，MSC可以阻止外來(lái)抗原特異性CD8+T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用[12]。2)MSC抑制B細(xì)胞：MSC抑制體外B細(xì)胞的增殖，并可以刺激B細(xì)胞分泌抗體，誘導(dǎo)B細(xì)胞多克隆分化和增殖，且與其間質(zhì)細(xì)胞的支持作用相符[13]。

3.組織修復(fù)和再生：MSC有相當(dāng)?shù)目伤苄裕粌H可以分化成中胚層細(xì)胞，還可以分化為外胚層組織(神經(jīng)細(xì)胞)和內(nèi)胚層組織(肝細(xì)胞)。MSC已經(jīng)被證實(shí)可以提高心肌功能、腦缺血后的腦功能修復(fù)肝臟和關(guān)節(jié)損傷等[14～16]。因?yàn)槭褂门咛ジ杉?xì)胞會(huì)引起很多倫理問題，所以現(xiàn)在許多臨床研究更傾向于使用成體干細(xì)胞比如MSC。

二、影響MSC增殖及治療效果的因素

但因MSC在成人組織中數(shù)量較少，需在體外培養(yǎng)達(dá)到一定的細(xì)胞數(shù)量才能起到治療的作用，所以首先找到最優(yōu)的MSC體外增殖的方法是非常必要的。目前發(fā)現(xiàn)MSC捐獻(xiàn)者的年齡、性別、接種密度都可能影響細(xì)胞的數(shù)量、治療效果。但是不同的文獻(xiàn)報(bào)道各不相同。

(1)捐獻(xiàn)者年齡和MSC增殖：關(guān)于捐獻(xiàn)者年齡和MSC增殖的關(guān)系，相悖的研究結(jié)果和文獻(xiàn)都有出現(xiàn)。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道捐獻(xiàn)者年齡和MSC增殖速率呈反比關(guān)系。其余則認(rèn)為兩者無(wú)相關(guān)。Khan在研究?jī)山M不同年齡(平均年齡分別為57歲和86歲)被試的滑膜脂肪墊來(lái)源的MSC時(shí)發(fā)現(xiàn)在MSC培養(yǎng)的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，MSC的增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這種趨勢(shì)也在其他許多文獻(xiàn)研究中被證實(shí)。但是Baxter等報(bào)道了相對(duì)于0～18歲的患者，59～75歲患者的MSC生長(zhǎng)能力嚴(yán)重受損，表現(xiàn)為明顯緩慢的生長(zhǎng)速度。

(2)捐獻(xiàn)者性別和MSC增殖：關(guān)于捐獻(xiàn)者性別和MSC增殖關(guān)系的文獻(xiàn)較少，因?yàn)榇蟛糠治墨I(xiàn)的分組同時(shí)包括男性和女性來(lái)源的MSC。Faustini等在研究脂肪來(lái)源的干細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)于男性來(lái)源的干細(xì)胞來(lái)說，最有效的消化是用0.2%膠原酶孵育1h，而對(duì)女性來(lái)源的干細(xì)胞則是過夜消化法更有效。女性捐獻(xiàn)者的干細(xì)胞增殖數(shù)量顯著高于男性。而且考慮到干細(xì)胞還有雌激素和雄激素受體，推測(cè)MSC的增殖很可能存在性別差異。

(3)接種密度對(duì)MSC增殖的影響:盡管有限，這部分文獻(xiàn)仍然認(rèn)為接種密度影響MSC增殖速率。Both等發(fā)現(xiàn)以低密度接種的MSC增殖速度更快，當(dāng)MSC以100/cm2密度接種達(dá)到目標(biāo)細(xì)胞數(shù)的時(shí)間比以5000/cm2密度接種快4.1天。Lode等也得到了同樣的結(jié)果，接種密度最高的細(xì)胞生長(zhǎng)速率最小，而接種密度最小的細(xì)胞生長(zhǎng)速率最高。高接種密度時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低可能是因?yàn)榧?xì)胞接觸抑制。而低接種密度時(shí)細(xì)胞高速的生長(zhǎng)可能是因?yàn)樾☆w粒細(xì)胞，即停滯期的循環(huán)干細(xì)胞，該細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)數(shù)階段大量增殖。

三、MSC的臨床應(yīng)用

1.MSC在心血管系統(tǒng)的應(yīng)用：根據(jù)WHO研究結(jié)果，心血管疾病是全球首位死亡原因。臨床前期的證實(shí)MSC可以提高嚙齒動(dòng)物和豬心肌梗死后的心臟功能。MSC優(yōu)先歸巢至梗死的心肌處非常重要。由于心肌梗死，增加了局部血管通透性，提高了趨化因子的釋放，上調(diào)黏附蛋白的表達(dá)，這些都有助于MSC的遷移。因此，MSC可以通過靜脈注射的途徑使用，從而避免了風(fēng)險(xiǎn)更高的輸注方式。設(shè)有安慰劑對(duì)照組的Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究(Osiris Therapeutics Inc. 網(wǎng)址:www.osiristx.com)結(jié)果顯示，來(lái)源于與患者人白細(xì)胞抗原不匹配的健康人的MSC，經(jīng)靜脈注入患有心肌梗死的患者體內(nèi)，與對(duì)照組相比，MSC能明顯提高心肌梗死患者的心臟射血分?jǐn)?shù)和肺功能，而且發(fā)生心率失常的概率更小。

2.MSC在移植物抗宿主病中的應(yīng)用：移植物抗宿主病(GVHD)是造血干細(xì)胞移植和供者淋巴細(xì)胞輸注后的常見并發(fā)癥，近年來(lái)對(duì)其發(fā)病機(jī)制的探索已取得很大的進(jìn)步。GVHD第1線的治療是腎上腺糖皮質(zhì)激素，其對(duì)50%～80%的患者有效，療效取決于起始發(fā)病時(shí)患者的嚴(yán)重程度。GVHD二線治療主要是免疫抑制劑，使用免疫抑制劑的1年生存率約為30%。而近期的研究發(fā)現(xiàn)MSC移植可改善GVHD患者的生存，如MSC移植可以延長(zhǎng)異基因皮膚移植物的存活時(shí)間。Weng進(jìn)行了1項(xiàng)對(duì)19名因患有血液系統(tǒng)惡性疾病行造血干細(xì)胞移植的患者進(jìn)行了為期3年零5個(gè)月的隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC的治療可以減少慢性難治性GVHD的免疫抑制劑，部分患者甚至可以停用免疫抑制劑。LeBlanc觀察到MSC對(duì)1個(gè)骨髓移植后4期GVHD有治療作用。MSC支持移植物的機(jī)制尚不清楚，可能和它們?cè)谠煅h(huán)境中的支持作用相關(guān)。MSC可以改變DC作為GVHD的中介物的作用。MSC可以阻止單核細(xì)胞和骨髓前體細(xì)胞分化為DC，在DC成熟過程中抑制CD1a、CD40、CD80、CD86和HLA-DR的上調(diào)，而Sbano等則認(rèn)為MSC仍存在一定免疫原性，其治療GVHD的安全性有待于更多研究的進(jìn)一步證實(shí)[17,18]。

3.MSC在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的應(yīng)用：MSC可以逆轉(zhuǎn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)小鼠和患者的多器官衰竭或狼瘡腎炎，這可能與MSC提高了Treg細(xì)胞的比例有關(guān)[19,20]。也有報(bào)道稱，在兩個(gè)有活動(dòng)性但炎癥表現(xiàn)不明顯的狼瘡患者身上，輸注自身MSC可以明顯提高Treg細(xì)胞比例卻無(wú)狼瘡癥狀的緩解[21]。還有研究者認(rèn)為MSC治療SLE的機(jī)制與恢復(fù)Th1/Th2平衡有關(guān)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明MSC可能通過調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞分泌IL-4和IFN-γ的水平促進(jìn)SLE小鼠中優(yōu)勢(shì)的Th2體液免疫反應(yīng)向Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)方向轉(zhuǎn)變。如Zhou等發(fā)現(xiàn)向狼瘡小鼠腹腔注射骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以抑制外周血T細(xì)胞IL-4的分泌、增加IFN-γ的分泌。這個(gè)理論在SLE患者身上也得到了證實(shí)，研究證實(shí)MSC促使免疫反應(yīng)向Th1方向的極化伴隨著患者臨床癥狀的緩解[22]。但是也有實(shí)驗(yàn)得到了相反的結(jié)果[23]。這些各有分歧的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MSC中介的效應(yīng)和SLE免疫發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，還需要我們進(jìn)一步研究。

4.MSC在哮喘中的應(yīng)用：哮喘是一類多種免疫細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)參與的氣道疾病，因此MSC作為一種免疫調(diào)節(jié)性的細(xì)胞被多次研究用于治療哮喘。Nemeth等[24]用MSC治療豚鼠草致敏的小鼠哮喘模型發(fā)現(xiàn)，在激發(fā)階段在小鼠體內(nèi)注入MSC可以避免小鼠出現(xiàn)哮喘特征性的病理改變包括嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)、肺內(nèi)過量的黏液分泌、肺泡灌洗液IL-4、IL-5和IL-13和血清IgG1、IgE的升高，究其機(jī)制，可能是IL-4和或IL-13激活了MSC的STAT6通路，導(dǎo)致TGF-β的分泌增高，同時(shí)還有可能聯(lián)合Treg細(xì)胞導(dǎo)致免疫的抑制。在一項(xiàng)對(duì)職業(yè)性哮喘的研究中， Martínez-González等[25]發(fā)現(xiàn)，人脂肪來(lái)源的MSC可以減輕哮喘職業(yè)哮喘模型早期的中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)、IgE分泌、抑制淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)而保護(hù)肺泡結(jié)構(gòu)、明顯抑制肺泡平滑肌細(xì)胞的肥大和增生和氣道高反應(yīng)性。

近年來(lái)多項(xiàng)研究均表明MSC的免疫調(diào)節(jié)能力在多種疾病中起到治療作用，是新型的臨床治療手段。但相悖的研究結(jié)果也時(shí)有出現(xiàn)，而這些不同的研究結(jié)果可能跟各不相同的研究對(duì)象、試劑和實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)。所以明確MSC在人群各種免疫失調(diào)性疾病中是否有治愈作用有重要意義。未來(lái)的研究重點(diǎn)應(yīng)是在確?；颊甙踩那疤嵯卤M可能開展多中心臨床試驗(yàn)，在確定MSC治療作用的基礎(chǔ)上研究其治療機(jī)制。

1 Bensidhoum M, Chapel A, Francois S,etal. Homing of in vitro expanded Stro-1-or Stro-1+ human mesenchymal stem cells into the NOD/SCID mouse and their role in supporting human CD34 cell engraftment[J]. Blood, 2004, 103(9): 3313-3319

2 Chapel A, Bertho JM, Bensidhoum M,etal. Mesenchymal stem cells home to injured tissues when co‐infused with hematopoietic cells to treat a radiation‐induced multi‐organ failure syndrome[J]. J Gene Med, 2003, 5(12): 1028-1038

3 Ortiz LA, Gambelli F, McBride C,etal. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects[J]. P Natl Acad Sci USA, 2003, 100(14): 8407-8411

4 Schraufstatter IU, DiScipio RG, Zhao M,etal. C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation[J]. J Immunology, 2009, 182(6): 3827-3836

5 Raffaghello L, Bianchi G, Bertolotto M,etal. Human mesenchymal stem cells inhibit neutrophil apoptosis: a model for neutrophil preservation in the bone marrow niche[J]. Stem Cells, 2008, 26(1): 151-162

6 Nauta AJ, Kruisselbrink AB, Lurvink E,etal. Mesenchymal stem cells inhibit generation and function of both CD34+-derived and monocyte-derived dendritic cells[J]. J Immunology, 2006, 177(4): 2080-2087

7 Jiang XX, Zhang YI, Liu B,etal. Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells[J]. Blood, 2005, 105(10): 4120-4126

8 Zhang W, Ge W, Li C,etal. Effects of mesenchymal stem cells on differentiation, maturation, and function of human monocyte-derived dendritic cells[J]. Stem Cells Dev, 2004, 13(3): 263-271

9 Spaggiari GM, Capobianco A, Becchetti S,etal. Mesenchymal stem cell-natural killer cell interactions: evidence that activated NK cells are capable of killing MSCs, whereas MSCs can inhibit IL-2-induced NK-cell proliferation[J]. Blood, 2006, 107(4): 1484-1490

10 Spaggiari GM, Capobianco A, Abdelrazik H,etal. Mesenchymal stem cells inhibit natural killer-cell proliferation, cytotoxicity, and cytokine production: role of indoleamine 2, 3-dioxygenase and prostaglandin E2[J]. Blood, 2008, 111(3): 1327-1333

11 Di Nicola M, Carlo-Stella C, Magni M,etal. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli[J]. Blood, 2002, 99(10): 3838-3843

12 Rasmusson I, Uhlin M, Le Blanc K,etal. Mesenchymal stem cells fail to trigger effector functions of cytotoxic T lymphocytes[J]. J Leukocyte Biol, 2007, 82(4): 887-893

13 Traggiai E, Volpi S, Schena F,etal. Bone marrow‐derived mesenchymal stem cells induce both polyclonal expansion and differentiation of B cells isolated from healthy donors and systemic lupus erythematosus patients[J]. Stem Cells, 2008, 26(2): 562-569

14 Fang B, Shi M, Liao L,etal. Systemic infusion of FLK1+ mesenchymal stem cells ameliorate carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice[J]. Transplantation, 2004, 78(1): 83-88

15 Murphy JM, Fink DJ, Hunziker EB,etal. Stem cell therapy in a caprine model of osteoarthritis[J]. Arthritis Rheumatol, 2003, 48(12): 3464-3474

16 Zhao LR, Duan WM, Reyes M,etal. Human bone marrow stem cells exhibit neural phenotypes and ameliorate neurological deficits after grafting into the ischemic brain of rats[J]. Exp Neurol, 2002, 174(1): 11-20

17 Djouad F, Charbonnier LM, Bouffi C,etal. Mesenchymal stem cells inhibit the differentiation of dendritic cells through an interleukin-6-dependent mechanism[J]. Stem Cells, 2007, 25(8): 2025-2032

18 Jiang XX, Zhang YI, Liu B,etal. Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells[J]. Blood, 2005, 105(10): 4120-4126

19 Sun L, Akiyama K, Zhang H,etal. Mesenchymal stem cell transplantation reverses multiorgan dysfunction in systemic lupus erythematosus mice and humans[J]. Stem Cells, 2009, 27(6): 1421-1432

20 Gu Z, Akiyama K, Ma X,etal. Transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells alleviates lupus nephritis in MRL/lpr mice[J]. Lupus, 2010, 19(13): 1502-1514

21 Carrion F, Nova E, Ruiz C,etal. Autologous mesenchymal stem cell treatment increased T regulatory cells with no effect on disease activity in two systemic lupus erythematosus patients[J]. Lupus, 2010, 19(3): 317-322

22 Sun L, Wang D, Liang J,etal. Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in severe and refractory systemic lupus erythematosus[J]. Arthritis Rheumatol, 2010, 62(8): 2467-2475

23 Chang JW, Hung SP, Wu HH,etal. Therapeutic effects of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell transplantation in experimental lupus nephritis[J]. Cell Transplant, 2011, 20(2): 245-257

24 Nemeth K, Keane-Myers A, Brown J M,etal. Bone marrow stromal cells use TGF-β to suppress allergic responses in a mouse model of ragweed-induced asthma[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(12): 5652-5657

25 Martínez-González I, Cruz M J, Moreno R,etal. Human mesenchymal stem cells resolve airway inflammation, hyperreactivity and histopathology in a mouse model of occupational asthma[J]. Stem Cells Dev, 2014,23 (19):2352-2363

(修回日期：2014-12-17)

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81270073)

200433 上海 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院呼吸內(nèi)科

白沖,電子信箱：bc7878@sohu.com

R593

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.003

2014-12-04)