劉小偉，陳以勝(綜述)，程世翔，涂 悅※(審校)

(1.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津 300193； 2.天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復重點實驗室 武裝警察部隊腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所武裝警察部隊后勤學院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院，天津 300162)

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受體相互作用蛋白1在顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞壞死性凋亡過程中的作用

劉小偉1,2△，陳以勝2△(綜述)，程世翔2，涂 悅2※(審校)

(1.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津 300193； 2.天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復重點實驗室 武裝警察部隊腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所武裝警察部隊后勤學院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院，天津 300162)

顱腦創(chuàng)傷可引起多種類型的細胞發(fā)生改變，包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和其他支持細胞等，其中神經(jīng)元死亡是引起神經(jīng)系統(tǒng)退化和致死的一個主要原因，因此其機制也是近些年的研究熱點。以往研究資料顯示，受體相互作用蛋白(RIP)家族在介導細胞死亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，尤其是RIP1在多種形式的細胞死亡過程中均扮演重要角色，包括近幾年研究新發(fā)現(xiàn)的壞死性凋亡，即一種不依賴含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的程序性細胞死亡類型。

顱腦創(chuàng)傷；壞死性凋亡；受體反應蛋白1

神經(jīng)細胞死亡是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展中的重要組成部分，也是在顱腦創(chuàng)傷的病理條件下清除不良細胞所必要的，然而過度的神經(jīng)細胞損失將可能引起急、慢性神經(jīng)退行性疾病。顱腦創(chuàng)傷的發(fā)病機制的基礎研究雖取得一些進展，但大部分顱腦創(chuàng)傷患者在經(jīng)過一定臨床治療后仍遺留不同程度的認知、行為和交流障礙[1]。受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)和RIP3由于特殊的細胞信號轉(zhuǎn)導機制和病理學性質(zhì)，一直以來研究較為廣泛。2000年Holler等[2]在應用FasL、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)及TNF相關(guān)的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)誘導細胞壞死時，發(fā)現(xiàn)RIP1是細胞壞死的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，RIP1的化學抑制劑necrostatin出現(xiàn)后，壞死的研究取得突破性進展，并逐漸明確程序性壞死這一細胞死亡類型。RIP3是Cho等[3]在2009年發(fā)現(xiàn)的受體反應蛋白家族的另一成員，并也被證實是細胞死亡受體信號轉(zhuǎn)導通路中的重要信號分子，參與到細胞的壞死性凋亡過程。RIP1和RIP3兩種蛋白在多種細胞死亡通路中同時出現(xiàn)?，F(xiàn)就RIP1在顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞壞死性凋亡過程中的作用。

1 RIP1的結(jié)構(gòu)與功能

RIP1在死亡受體信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮著多重作用，既涉及介導核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)的活性調(diào)節(jié)從而促進細胞生存，也涉及介導細胞的凋亡和壞死性凋亡過程[4]。RIP1是一類絲/蘇氨酸激酶，包括3個主要的結(jié)構(gòu)域，分別為N端激酶結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和C端的能與腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡區(qū)域(TNF receptor associated death domain，TRADD)相結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，其中N端的絲/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域?qū)τ趬乃佬缘蛲鲞^程不可或缺，但在激活NF-κB和細胞凋亡過程中并非必需[2]。當?shù)蛲雎窂奖蛔钄鄷r，RIP1和壞死性凋亡由死亡受體的配體(如TNF-α、Fas等)激活[5]。necrostatin-1(Nec-1)作為壞死性凋亡的抑制劑，同時也是RIP1的有效抑制劑。Ortolano等[6]發(fā)現(xiàn)，RIP1抑制劑可減少控制性皮質(zhì)損傷大鼠的神經(jīng)細胞死亡并增強運動和認知功能，由此推測RIP1在顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞壞死性凋亡過程中具有重要作用。Degterev和Yuan[4]研究證實，RIP1作為其主要上游信號也參與到壞死性凋亡這一過程。由此可見，RIP1是細胞死亡程序中的重要靶點。

2 RIP1介導細胞壞死性凋亡的機制

TNF-α是最普遍應用于研究壞死性凋亡的因子，TNF受體1(TNF receptor 1，TNFR1)則作為主要的受體參與其中[7]，RIP1在壞死性凋亡信號轉(zhuǎn)導過程中的作用是與凋亡和NF-κB 的活化機制聯(lián)系在一起的。對于許多類型細胞，TNF-α刺激并不引起凋亡和壞死性凋亡，除非NF-κB信號被阻斷[8]。當胞膜上的TNFR被激活后，RIP1信號將導致細胞產(chǎn)生不同的后果。

細胞凋亡的途徑主要分細胞外的死亡受體途徑和細胞內(nèi)的線粒體途徑兩種類型，其中后者是各種刺激因素通過影響細胞內(nèi)線粒體膜電位，從而使胞內(nèi)Ca2+濃度升高，pH值下降，進一步激活胱天蛋白酶(caspase)9，并通過一系列信號轉(zhuǎn)導，引起細胞凋亡；RIP1主要是參與前者中發(fā)揮作用，在細胞外的死亡受體途徑中，由TNFR家族介導，經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導，激活caspase-8，并最終引起細胞凋亡[8]。TNF-α與TNFR1 結(jié)合后，引起TNFR1的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在細胞內(nèi)裝配形成TNFR復合體Ⅰ，該復合體包括以下幾個組分：TRADD、RIP1、TNFR相關(guān)因子2(TNFR-associated factor 2，TRAF2)以及TRAF5。TNFR復合體Ⅰ形成后，TNFR1從復合體上解離，此時細胞質(zhì)中的RIP3與復合體中的RIP1相結(jié)合，F(xiàn)as相關(guān)死亡域蛋白(Fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD)通過內(nèi)吞作用進入細胞與TRADD結(jié)合，最終形成TNFR復合體Ⅱ(即TRADD-FADD-RIP1-RIP3組合體)[9]。FADD繼而募集caspase-8并進行自我活化，啟動經(jīng)典的外源性細胞凋亡途徑。凋亡途徑啟動的同時，caspase-8發(fā)生裂解，導致RIP1和RIP3失活，從而阻斷壞死性凋亡通路[9-10]。由此可見，在一般情況下，死亡受體的激活將誘導細胞發(fā)生凋亡，而只有當caspase-8功能被阻斷時，細胞才將啟動壞死性凋亡。壞死性凋亡與凋亡具有部分共同的通路，只是從形成TNFR復合體Ⅱ 之后，凋亡途徑需要依賴caspase的參與，而壞死性凋亡則需要抑制caspase的活性。當?shù)蛲鐾緩奖坏蛲鲆种苿?如細胞凋亡抑制因子cIAP1、cIAP2或E3泛素連接酶)阻斷時，TNFR的配體(如TNF-α、Fas)激活RIP1，經(jīng)一系列信號轉(zhuǎn)導，最后由caspase活性抑制劑zVAD激活壞死性凋亡。RIP1如何被激活并啟動由caspase抑制物引起的壞死性凋亡尚不明確，但可推定RIP1被凋亡抑制物泛素化，泛素化狀態(tài)可調(diào)節(jié)RIP1的活性[11]。caspase-8一旦被藥物或者RNA干擾等因素所阻斷，RIP1和RIP3便可被某種激酶磷酸化，繼續(xù)啟動不依賴caspase參與的壞死性凋亡。磷酸化后的RIP1和RIP3發(fā)生構(gòu)象，兩者相互結(jié)合得更加緊密，使TNFR復合體Ⅱ的穩(wěn)定性大大增強，與此同時RIP3被激活，繼續(xù)啟動下游信號通路。RIP1和RIP3的結(jié)合與磷酸化是壞死性凋亡的關(guān)鍵性和特異性步驟，是壞死性凋亡發(fā)生的標志[12]。但也有研究認為，TNF可以在缺乏RIP1的情況下激活RIP3，最終引發(fā)壞死性凋亡[13]。

TNFR復合體Ⅰ中的TNFR相關(guān)因子2可繼續(xù)結(jié)合凋亡蛋白細胞抑制物，該抑制物可介導Lys63發(fā)生泛素化，在泛素化的過程中，RIP1充當腳手架蛋白的角色，可使轉(zhuǎn)化生長因子B激活激酶1(transforming growth factor-B activated kinase 1，TAK1)、TAK結(jié)合蛋白2(TAK1-binding protein 2，TAB2)和TAB3在此基礎上相互結(jié)合，從而形成TAK1-TAB2-TAB3復合物，最終激活NF-κB[10]。而對于NF-κB激活的調(diào)節(jié)也比較特殊，包括正反饋調(diào)節(jié)和負反饋調(diào)節(jié)兩個方面。NF-κB的激活可以引起細胞內(nèi)某些因子的表達量增加，比如腫瘤壞死因子和白細胞介素1等，這些因子的表達增加又可反過來激活NF-κB[14]，最終都對細胞死亡有一定的增強和促進作用。

3 顱腦創(chuàng)傷與壞死性凋亡

從一般概念上講，顱腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)細胞死亡根據(jù)其特點可分為原發(fā)性死亡和繼發(fā)性死亡。前者指細胞膜瓦解所致的細胞直接死亡；后者反映的是受傷部位周圍和遠離受傷區(qū)域的細胞遲發(fā)性或繼發(fā)性死亡，是由于創(chuàng)傷引起細胞發(fā)生生理或生化改變而導致的[15]。目前對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞死亡研究仍具有一定的挑戰(zhàn)性，因為即使在超微結(jié)構(gòu)水平，對死亡神經(jīng)細胞的描述與人體內(nèi)其他組織死亡細胞也不盡相同。如Oney等[16]運用超微技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)了大腦內(nèi)的兩種神經(jīng)細胞死亡方式：生理性細胞死亡和興奮毒性細胞死亡，前者類似于細胞凋亡，而后者類似于細胞脹亡，都與人體其他組織的細胞死亡有一定差異。

過去一般將顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞的死亡方式歸為兩類：壞死和凋亡。壞死是一種細胞被動死亡，通常伴隨著離子平衡和胞膜完整性的破壞，以及器官和細胞的腫脹。而凋亡是一種需要消耗能量的細胞主動死亡過程，通常伴隨著細胞質(zhì)和細胞核的濃縮、細胞體積變小，但保持相關(guān)器官結(jié)構(gòu)的完整性[1]。這種命名方式當然有其局限性，因為壞死的形態(tài)和凋亡的機制可同時聯(lián)系在一起[17]。實際上壞死和凋亡這兩種細胞死亡類型經(jīng)常同時存在，中間形態(tài)也被鑒別出來，最初有人提出aponecnosis這一新詞[18]，即壞死性凋亡這一新型細胞死亡模式，Degterev等[5]深入研究并首次報道，命名其為necroptosis。

顱腦創(chuàng)傷后不論是出血性還是缺血性損傷，引起神經(jīng)細胞死亡的根本原因都是腦缺血，所有保護神經(jīng)策略的核心就是防止缺血性(繼發(fā)性)損傷[19]。缺血性損傷通常會引起凋亡，但近年來的研究表明壞死性凋亡也是缺血性腦損傷的重要機制之一[20]。隨著研究的進展，程序性死亡逐漸被證實是顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞死亡并導致患者預后不良的主要原因[21]。過去對程序性死亡的認識僅局限于凋亡，隨著細胞生物學研究的深入，新形式的細胞死亡途徑逐漸被揭示，如脹亡、自噬、副凋亡等，各種機制相互交聯(lián)，并有彼此重疊的機制出現(xiàn)。然而壞死性凋亡作為研究的重點，仍存在著許多未知。

導致細胞發(fā)生壞死性凋亡的因素很多，包括諸如腫瘤壞死家族(如TNF-α)、Fas等配體，物理或化學性損傷，低氧狀態(tài)等[22]，其中以TNF-α研究最為普遍。顱腦創(chuàng)傷后，缺血缺氧、感染和興奮毒性作用被認為是誘發(fā)壞死性凋亡的主要因素，這些因素進一步發(fā)生連鎖式的反應，如產(chǎn)生活性氧類(reactive oxygen species，ROS)，釋放興奮性氨基酸、促炎細胞因子(如IL-1γ、IL-18、TNF-α)[23]、趨化因子、TNF(如TNF-α、TNF-β、FasL、TRAIL、TWEAK)[24]，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導最終引起凋亡或壞死性凋亡的發(fā)生。許多證據(jù)表明，Redox對調(diào)控壞死性凋亡發(fā)揮著重要作用，Vanlangenakker等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在壞死性凋亡早期階段ROS的量急劇增高，而抑制ROS的產(chǎn)生則可以減少壞死性凋亡。誘發(fā)壞死性凋亡大都要涉及RIP1這一中間因子，RIP1不僅調(diào)控壞死性凋亡中TNFR1 的下游信號，而且對TNF-α的產(chǎn)生也有一定作用，在一定條件下，RIP1可促使TNF-α釋放增多，從而又反過來促進細胞壞死性凋亡的進行[12]。

4 對顱腦創(chuàng)傷后壞死性凋亡的干預

TNF誘導的細胞壞死性凋亡以及RARP通路，展現(xiàn)了壞死性凋亡的兩種獨特途徑，病理狀態(tài)下的壞死性凋亡的重要性也越來越明顯[26]。Linkermann等[27]發(fā)現(xiàn)通過靶向抑制RIP1可大大降低實驗大鼠的腎臟、視網(wǎng)膜和心臟的缺血再灌注損傷，抑制顱腦創(chuàng)傷的惡化，并能增強其運動及認知功能。Krishnakumar和Kraus[28]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制PARP-1，也可有效治療腦卒中及心肌缺血等疾病，對1型糖尿病、多發(fā)性硬化、類風濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病也有很大的治療前景。

Nec-1作為目前應用最為廣泛的壞死性凋亡抑制劑，與壞死性凋亡信號轉(zhuǎn)導過程中的特異性分子RIP1-RIP3成為研究壞死性凋亡的重要手段，包括對顱腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)細胞死亡進行研究，并揭示了許多類型的細胞壞死實際上是壞死性凋亡，如谷氨酸誘導的海馬神經(jīng)元壞死[29]、心肌缺血性損傷[30]等。此外，目前還有其他一些壞死性凋亡的抑制劑，如乙內(nèi)酰脲、三環(huán)衍生物等[31]，這些基本都是在實驗的背景下應用。

5 展 望

顱腦創(chuàng)傷后的繼發(fā)性腦損害非常重要，除了涉及細胞壞死外，還包括壞死性凋亡，后者由于是程序性細胞死亡，在一定條件下可以逆轉(zhuǎn)，臨床醫(yī)師可以把握這一時期的治療，盡可能降低神經(jīng)細胞的壞死凋亡，改善患者病情和生存質(zhì)量。過去對于RIP1和RIP3的研究已經(jīng)取得一定成果，并解釋了關(guān)于細胞死亡的一些相關(guān)機制，但并未形成有效的應用于臨床上的具體治療方法。RIP1作為介導壞死性凋亡的關(guān)鍵因子，可以對其靶向抑制，以干擾壞死性凋亡的信號傳遞路徑，從而驗證各種干預措施對壞死性凋亡的效果，并制訂臨床上針對顱腦創(chuàng)傷的治療措施。

[1] Veenith T,Goon SSh,Burnstein RM,etal.Molecular mechanisms of traumatic brain injury:the missing link in management[J].World J Emerg Surg,2009,4(1):7.

[2] Holler N,Zaru R,Micheau O,etal.Fas triggers an alternative,caspase-8-independent cell death pathway using the kinase RIP as effector molecule[J].Nat Immunol,2000,1(6):489-495.

[3] Cho YS,Challa S,Moquin D,etal.Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation[J].Cell,2009,137(6):1112-1123.

[4] Christofferson DE,Yuan J.Necroptosis as an alternative form of programmed cell death[J].Curr Opin Cell Biol,2010,22(2):263-268.

[5] Degterev A,Huang Z,Boyce M,etal.Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury[J].Nat Chem Biol,2005,1(2):112-119.

[6] Ortolano F,Colombo A,Zanier ER,etal.c-Jun N-terminal kinase pathway activation in human and experimental cerebral contusion[J].J Neuropathol Exp Neurol,2009,68(9):964-971.

[7] Stoica BA,Faden AI.Cell death mechanisms and modulation in traumatic brain injury[J].Neurotherapeutics,2010,7(1):3-12.

[8] Oeckinghaus A,Hayden MS,Ghosh S.Crosstalk in NF-κB signaling pathways[J].Nat Immunol,2011,12(8):695-708.

[9] Kreuz S,Siegmund D,Scheurich P,etal.NF-kappaB inducers upregulate cFLIP,a cycloheximide-sensitive inhibitor of death receptor signaling[J].Mol Cell Biol,2001,21(12):3964-3973.

[10] Micheau O,Tschopp J.Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes[J].Cell,2003,114(2):181-190.

[11] 陳牧,黃雷.Necroptosis信號通路與靶向治療的研究進展[J].生命科學,2012,24(7):666-673.

[12] Christofferson DE,Li Y,Hitomi J,etal.A novel role for RIP1 kinase in mediating TNFα production[J].Cell Death Dis,2012,3:e320.

[13] Ye YC,Yu L,Wang HJ,etal.TNFα-induced necroptosis and autophagy via supression of the p38-NF-κB survival pathway in L929 cells[J].J Pharmacol Sci,2011,117(3):160-169.

[14] Moujalled DM,Cook WD,Okamoto T,etal.TNF can activate RIPK3 and cause programmed necrosis in the absence of RIPK1[J].Cell Death Dis,2013,4:e465.

[15] Kulms D,Schwarz T.NF-kappaB and cytokines[J].Vitam Horm,2006,74:283-300.

[16] Dikranian K,Ishimaru MJ,Tenkova T,etal.Apoptosis in the in vivo mammalian forebrain[J].Neurobiol Dis,2001,8(3):359-

379.

[17] Yu SW,Andrabi SA,Wang H,etal.Apoptosis-inducing factor mediates poly (ADP-ribose) (PAR) polymer-induced cell death[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(48):18314-18319.

[18] Formigli L,Papucci L,Tani A,etal.Aponecrosis:morphological and biochemical exploration of a syncretic process of cell death sharing apoptosis and necrosis[J].J Cell Physiol,2000,182(1):41-49.

[19] Polderman KH.Induced hypothermia and fever control for prevention and treatment of neurological injuries[J].Lancet,2008,371(9628):1955-1969.

[20] You Z,Savitz SI,Yang J,etal.Necrostatin-1 reduces histopathology and improves functional outcome after controlled cortical impact in mice[J].J Cereb Blood Flow Metab,2008,28(9):1564-1573.

[21] Minambres E,Ballesteros MA,Mayorga M,etal.Cerebral apoptosis in severe traumatic brain injury patients:an in vitro,in vivo,and postmortem study[J].J Neurotrauma,2008,25(6):581-591.

[22] Vandenabeele P,Galluzzi L,Vanden Berghe T,etal.Molecular mechanisms of necroptosis:an ordered cellular explosion[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2010,11(10):700-714.

[23] Hagberg H,Mallard C.Effect of inflammation on central nervous system development and vulnerability[J].Curr Opin Neurol,2005,18(2):117-123.

[24] Taylor DL,Jones F,Kubota ES,etal.Stimulation of microglial metabotropic glutamate receptor mGlu2 triggers tumor necrosis factor alpha-induced neurotoxicity in concert with microglial-derived Fas ligand[J].J Neurosci,2005,25(11):2952-2964.

[25] Vanlangenakker N,Vanden Berghe T,Bogaert P,etal.cIAP1 and TAK1 protect cells from TNF-induced necrosis by preventing RIP1/RIP3-dependent reactive oxygen species production[J].Cell Death Differ,2011,18(4):656-665.

[26] Sosna J,Voigt S,Mathieu S,etal.TNF-induced necroptosis and PARP-1-mediated necrosis represent distinct routes to programmed necrotic cell death[J].Cell Mol Life Sci,2014,71(2):331-348.

[27] Linkermann A,Br?sen JH,Himmerkus N,etal.Rip1 (receptor-interacting protein kinase 1) mediates necroptosis and contributes to renal ischemia/reperfusion injury[J].Kidney Int,2012,81(8):751-761.

[28] Krishnakumar R,Kraus WL.The PARP side of the nucleus:molecular actions,physiological outcomes,and clinical targets[J].Mol Cell,2010,39(1):8-24.

[29] Xu X,Chua CC,Kong J,etal.Necrostatin-1 protects against glutamate-induced glutathione depletion and caspase-independent cell death in HT-22 cells[J].J Neurochem,2007,103(5):2004-2014.

[30] Smith CC,Yellon DM.Necroptosis,necrostatins and tissue injury[J].Cell Mol Med,2011,15(9):1797-1806.

[31] Teng X,Keys H,Yuan J,etal.Structure-activity relationship and liver microsome stability studies of pyrrole necroptosis inhibitors[J].Bioorg Med Chem Lett,2008,18(11):3219-3223.

The Role of Receptor-interacting Protein-1 in Neuronal Cell Necroptosis after Traumatic Brain Injury

LIUXiao-wei1,2,CHENYi-sheng2,CHENGShi-xiang2,TUYue2.

(1.GraduateSchoolofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China; 2.TianjinKeyLaboratoryofNeurotraumaRepair,InstituteofTraumaticBrainInjuryandNeuroscienceofChineseArmedPoliceForces,Neurology&NeurosurgeryHospitalofAffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChineseArmedPoliceForces,Tianjin300162,China)

Traumatic brain injury may induce changes in multiple cell types, such as neurons,gliocytes,astricytos,and other supporting cells.However,neuron death is a major cause of the degeneration of the central nervous system,as well as death.The mechanisms of neuronal cell death have been the predominant focus.Data demonstrate that receptor-interacting protein-1 plays a key role in mediating cell death processes, and is critically involved in mediating necroptosis, a Caspase-independent pathway of programmed cell death highlighted in recent years.

Traumatic brain injury; Necroptosis; Receptor-interacting protein-1

國家自然科學基金(31200809)；武警后勤學院科研創(chuàng)新團隊(WHTD201306)

R329. 2

A

1006-2084(2015)12-2145-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.012

2014-08-25

2014-11-25 編輯：相丹峰