農珍妮，趙鐘興*，韋藤幼，覃歡歡，楊 武

（1.廣西大學化學化工學院，廣西高校資源化工應用新技術重點實驗室，廣西理工科學實驗中心，廣西 南寧 530004；2.廣西民族大學相思湖學院，廣西 南寧 530008）

具有DPPH自由基抑制活性的蠶蛹蛋白酶解液脫色工藝優(yōu)化

農珍妮1,2，趙鐘興1,*，韋藤幼1，覃歡歡1，楊 武1

（1.廣西大學化學化工學院，廣西高校資源化工應用新技術重點實驗室，廣西理工科學實驗中心，廣西 南寧 530004；2.廣西民族大學相思湖學院，廣西 南寧 530008）

利用木瓜蛋白酶水解的蠶蛹蛋白酶解液作為研究原料，根據(jù)響應面試驗設計方法，以脫色率和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除保持率作為響應面指標，得最佳脫色工藝條件為：活性白土、堿性鈣基膨潤土和膨潤土按照質量比1∶1∶1混合為脫色劑、脫色劑用量1.9%、酶解液質量濃度9.61 mg/mL、pH 7.2、水浴溫度60 ℃、振蕩轉速150 r/min、脫色時間1.0 h。在此條件下實驗，得出DPPH自由基清除保持率84.5%、脫色率94.5%，與預測值相比誤差值均小于5%，說明采用響應面試驗設計方法對蠶蛹蛋白酶解液脫色體系進行優(yōu)化具有較好的可靠性。最后再對脫色前后酶解液中各氨基酸含量進行比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)脫色處理后酶解液中對DPPH自由基抑制有顯著作用的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸含量減少。

蠶蛹蛋白；DPPH自由基清除率；脫色；響應面分析

蠶蛹為蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的蛹，是養(yǎng)蠶業(yè)主要的副產(chǎn)物。蠶蛹蛋白占干蠶蛹質量的45%～50%[1]，含有18種人體所需的氨基酸，其中8種人體必需氨基酸含量占氨基酸總量48%以上[2-3]。從目前研究結果來看蠶蛹蛋白酶解后產(chǎn)物具有較好的抗氧化活性[4-6]，可以作為抗氧化活性肽來源應用到食品和醫(yī)藥行業(yè)，但是蠶蛹蛋白酶解液呈黃綠色，如果直接應用到食品添加劑或藥物中在色澤上不易被消費者接受，因此需要對酶解液進行脫色處理。目前常用的脫色方法有活性炭法[7-8]、離子交換樹脂法[9-10]、有機溶劑法[11-12]等，但這些方法存在蛋白損失率高、工藝復雜或造成二次污染等問題。膨潤土（簡稱皂土）是一種具有較好物理吸附效果的天然水硅酸鋁礦物石。膨潤土經(jīng)酸處理后在層間的金屬離子被氫離子置換形成酸性中心，而具有對堿性物質的吸附能力和離子交換性能，該類型膨潤土被稱為活性白土（簡稱白土）。將膨潤土經(jīng)酸活化、堿負載可得到堿性鈣基膨潤土（簡稱堿土）[13-16]，該類型膨潤土由于在膨潤土層間的羥基結構使其形成堿性中心對酸性物質吸附能力較強。本研究采用膨潤土、活性白土和堿性鈣基膨潤土的混合材料作為脫色劑，對具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基抑制活性的蠶蛹蛋白酶解液進行脫色研究，采用單因素試驗和響應面優(yōu)化脫色工藝條件[17-19]，并通過液相色譜法分析脫色前后酶解液中各氨基酸含量的變化，為蠶蛹蛋白酶解液的脫色深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶蛹蛋白粉（蛋白含量85.1%）、堿性鈣基膨潤土實驗室自制；繅絲后的蠶蛹 宜州市豐華繅絲廠；木瓜蛋白酶 南寧龐博生物有限公司；DPPH 美國Sigma公司；活性白土 河南亨潤環(huán)保科技有限公司；皂土 上海試劑四廠；粉末活性炭 廣東省臺山市化工廠。其他試劑都為分析純。

1.2 儀器與設備

1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；510型pH計 新加坡Eutech公司；4K15冷凍離心機 美國Sigma公司；冷凍干燥器系統(tǒng) 美國Labconco公司；UV-2501紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 脫色效果評價[20]

式中：A1為脫色前吸光度；A2為脫色后吸光度。

1.3.2 DPPH自由基抑制效果測定

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機自由基，其乙醇溶液呈紫色并在517nm波長處有強吸收峰，而當有抗氧化劑與DPPH自由基的單電子配對時，會使DPPH自由基乙醇溶液顏色變淺，其褪色程度與接受的電子數(shù)量呈線性關系，可用于檢測自由基清除程度[5]。

式中：Ai為樣品對DPPH自由基作用后的吸光度；Aj為測定中樣品自身的吸光度；Ac為DPPH自由基自身的吸光度。

式中：Ri為蠶蛹蛋白酶解原液中DPPH自由基清除率/%；Rj為脫色后蠶蛹蛋白酶解液中DPPH自由基清除率/%。

1.3.3 蠶蛹蛋白酶解液的制備

選用木瓜蛋白酶為水解酶，以實驗室已優(yōu)化的工藝條件制備酶解液，該條件下DPPH自由基清除率為84.0%。

1.3.4 脫色工藝條件優(yōu)化

將一定量脫色劑與20 mL蠶蛹蛋白酶解液混合后放入恒溫水浴振蕩器中，在一定溫度和轉速條件下振蕩脫色后離心去除剩余脫色劑（5 000 r/min、20 min），上清液采用吸光度法檢測脫色率和DPPH自由基清除保持率。

根據(jù)單因素試驗結果，選取影響顯著因素脫色劑用量（X1）、酶解液初始pH值（X2）和酶解液質量濃度（X3）為考察對象，以脫色率（Y1）和DPPH自由基清除保持率（Y2）為響應值，采用軟件Design-Expert 8.0.6進行分析，影響因素水平及編碼見表1。

表 1 中心組合試驗因素水平及編碼設計Table 1 Factors and coded levels used in CCD design

1.3.5 脫色前后蠶蛹蛋白酶解液中各氨基酸含量的比較

將脫色前后蠶蛹蛋白酶解液分別微濾濃縮后冷凍干燥，精確稱取適量按照已建立的柱前衍生化-高效液相色譜法[21-22]測定各氨基酸含量，比較脫色前后各氨基酸含量的變化。

2 結果與分析

2.1 蠶蛹蛋白酶解液脫色檢測波長的確定

圖 1 蠶蛹蛋白酶解液吸光度與波長關系曲線Fig.1 The maximum absorption peak of PSP hydrolyzate

在波長400～700 nm可見光范圍內，對5 mg/mL蠶蛹蛋白酶解液掃峰測定吸光度，如圖1所示。從圖1可以看出，隨波長增加，吸光度不斷下降，在可見光區(qū)不存在明顯吸收峰，其可能原因是有色物質較多吸收峰較復雜，從實驗現(xiàn)象來看蠶蛹蛋白酶解液呈淺黃綠色，從溶液互補色角度考慮選擇550 nm為檢測波長，計算脫色率[23]。

2.2 蠶蛹蛋白脫色條件工藝優(yōu)化

2.2.1 脫色劑種類對脫色效果的影響

選用活性炭、皂土、白土、堿土按照1.3.4節(jié)實驗步驟脫色，脫色條件為：脫色劑用量1.0%、質量濃度9.65 mg/mL的酶解液初始pH 7.0、振蕩轉速100 r/min、水浴溫度40 ℃、脫色時間1.0 h。

表 2 脫色劑種類的選擇Table 2 Selection of decolorant

活性炭和皂土主要是以物理吸附為主；白土在層間具有酸性中心，由于擴散作用能使蛋白酶解液中部分具有堿性的有色物質被吸附而產(chǎn)生脫色效果，因而兼具物理吸附和化學吸附作用；堿土層間的氫氧根除了具有陰離子交換功能外，還能與水分子形成氫鍵，可選擇性吸附反應體系中部分有色物質，因而也兼具物理吸附和化學吸附作用。從表2可以看出，活性炭脫色效果最好，但是其作為物理吸附在去除有色物質的同時也將蛋白質、多肽一同吸附導致DPPH自由基清除保持率太低而被排出；皂土也是以物理吸附為主，雖然DPPH自由基清除保持率很高但是脫色效果差；白土和堿土同時具有物理吸附和化學吸附兩種功效，將其混合使用由于白土的酸性中心和堿土的堿性中心都在膨潤土的層間，相互之間很難發(fā)生酸堿中和反應，此時DPPH自由基清除保持率和脫色率都較高?？紤]到實驗工作量的原因，只對堿性白土、活性白土和皂土3種脫色劑進行簡單復配，選擇2種脫色劑質量比1∶1混合和3種脫色劑質量比1∶1∶1混合共4個實驗點進行實驗，通過表2的數(shù)據(jù)分析確定選擇白土、堿土和皂土按照1∶1∶1混合制備脫色劑[24-25]。

2.2.2 脫色劑用量對脫色效果的影響

選用白土、堿土和皂土混合物為脫色劑，按照1.3.4節(jié)實驗步驟脫色，脫色條件為：質量濃度9.65 mg/mL的酶解液初始pH 7.0、振蕩轉速100 r/min、水浴溫度40 ℃、脫色時間1.0 h。

從圖2可以看出，脫色率隨脫色劑用量的增加不斷上升，與此同時脫色劑用量增加也會導致DPPH自由基清除保持率不斷下降，當脫色劑用量為2.0%時，脫色率已取得較好效果而DPPH自由基清除保持率也沒有較明顯的下降。

圖 2 脫色劑用量對脫色效果的影響Fig.2 Effect of decolorant concentration on the decolorization effi ciency

2.2.3 酶解液初始pH值對脫色效果的影響

選用白土、堿土和皂土混合物為脫色劑，按照1.3.4節(jié)實驗步驟脫色，脫色條件為：脫色劑用量2.0%、質量濃度9.65 mg/mL的酶解液、振蕩轉速100 r/min、水浴溫度40℃、脫色時間1.0 h。

圖 3 酶解液初始pH值對脫色效果的影響Fig.3 Effect of hydrolyzate pH on the decoloring effi ciency

從圖3可以看出，不同酶解液初始pH值有不同的脫色率和DPPH自由基清除保持率，這是因為溶液的pH值往往會影響吸附劑或被吸附質解離情況，進而影響吸附量。在pH值大于7.0和pH值小于7.0時的脫色率和DPPH自由基清除保持率都較低，白土-皂土-堿土混合既有物理吸附和化學吸附兩種功效，在pH值為7.0時脫色率和DPPH自由基清除保持率為最高。

2.2.4 脫色時間對脫色效果的影響

圖 4 脫色時間對脫色效果的影響Fig.4 Effect of decolorization time on the decolorization effi ciency

選用白土、堿土和皂土混合物為脫色劑，按照1.3.4節(jié)實驗步驟脫色，脫色條件為：脫色劑用量2.0%、質量濃度9.65 mg/mL的酶解液初始pH 7.0、振蕩轉速100 r/min、水浴溫度40 ℃。

從圖4可以看出，脫色時間超過1.0 h后脫色率不再明顯上升，而DPPH自由基清除保持率則下降明顯，可能的主要原因是吸附劑具有選擇性吸附作用，隨脫色時間延長酶解液中被吸附物質逐漸由色素類物質向蛋白、多肽等小分子活性物質轉變，導致DPPH自由基清除保持率不斷下降，綜合考慮選擇脫色時間1.0 h為最佳值。

2.2.5 水浴溫度對脫色效果的影響

選用白土、堿土和皂土混合物為脫色劑，按照1.3.4節(jié)實驗步驟脫色，脫色條件為：脫色劑用量2.0%、質量濃度9.65 mg/mL的酶解液初始pH 7.0、振蕩轉速100 r/min、脫色時間1.0 h。

圖 5 水浴溫度對脫色效果的影響Fig.5 Effect of decolorization temperature on the decolorization effi ciency

由圖5可以看出，隨著溫度的升高脫色率呈現(xiàn)先快速上升后緩慢增加的過程，因為在低溫時吸附過程往往在短時間內達不到平衡，隨溫度升高吸附速率加快并出現(xiàn)吸附量增加的情況，且皂土的吸附屬于物理吸附，當吸附達到平衡時，升高溫度反而會使吸附量增量降低。隨著溫度的升高DPPH自由基清除保持率變化并不大，但當溫度升高到70 ℃時DPPH自由基活性抑制肽存在溫度失活情況，最終選擇60 ℃作為最佳水浴溫度。

2.2.6 振蕩轉速對脫色效果的影響

選用白土、堿土和皂土混合物為脫色劑，按照1.3.4節(jié)實驗步驟脫色，脫色條件為：脫色劑用量2.0%、質量濃度9.65 mg/mL的酶解液初始pH 7.0、水浴溫度60 ℃、脫色時間1.0 h。

圖 6 振蕩轉速對脫色效果的影響Fig.6 Effect of rotation speed on the decolorization effi ciency

從圖6可以看出，隨轉速增加脫色率不斷增加，到150 r/min已達到最大值，而DPPH自由基清除保持率隨轉速的增加不斷下降，其下降原因與脫色時間相同。

2.2.7 酶解液質量濃度對脫色效果的影響

選用白土、堿土和皂土混合物為脫色劑，按照1.3.4節(jié)實驗步驟脫色，脫色條件為：脫色劑用量2.0%、酶解液初始pH 7.0、水浴溫度60 ℃、振蕩轉速150 r/min、脫色時間1.0 h。

圖 7 酶解液質量濃度對脫色效果的影響Fig.7 Effect of hydrolysate concentration on the decolorization effi ciency

由圖7可以看出，因吸附劑的單位負載量有限，隨酶解液質量濃度升高脫色率不斷下降，而酶解液單位質量濃度所含抗氧化肽越多DPPH自由基清除保持率也越高，綜合考慮選擇酶解液質量濃度為9.65mg/mL作為最佳質量濃度。

2.3 響應面法優(yōu)化工藝的確定

2.3.1 回歸方程的建立及方差分析

對變量Y1、Y2和自變量X1、X2、X3，應用最小二乘法假設擬合二次多元回歸方程（模型）為：

式中：A0為常數(shù)項；A1、A2、A3為一次項；A12、A13、A23為交互項；A11、A22、A33為平方項的回歸方程系數(shù)，為求二次方程各項系數(shù)，利用統(tǒng)計軟件Design-Expert 8.0.6來進行試驗設計。

按照表1的設計方案得到結果如表3所示。對表3中數(shù)據(jù)進行方差分析、參數(shù)估計及顯著性檢驗，具體結果見表4、5，并通過回歸分析得二次多元回歸方程（模型）為：

由表4可以看出，脫色率（Y1）的回歸方程極顯著，失擬項F檢驗不顯著（P=0.082 2＞0.05），說明回歸方程的擬合程度較好且模型調整確定系數(shù)R為0.974 0，即能解釋97.40%響應值的變化，說明該模型基本適合蠶蛹蛋白酶解體系中脫色率的分析和預測，且X1、X2、X3、、影響極顯著（P＜0.01）。由表5可以看出，DPPH自由基清除保持率（Y2）的回歸方程極顯著，失擬項F檢驗不顯著（P=0.062＞0.05），說明回歸方程的擬合程度較好且模型調整確定系數(shù)為0.881 9，即能解釋88.19%響應值的變化，說明該模型基本適合蠶蛹蛋白酶解體系中DPPH自由基清除保持率的分析和預測，且X3、影響極顯著（P＜0.01）。這表明響應值Y1、Y2的變化具有一定復雜性，各試驗因素對響應值不是簡單線性關系。

表 3 中心組合試驗設計方案和結果Table 3 CCD experimental scheme with predicted and experimental results

表 4 脫色率為響應值的回歸方程方差分析表Table 4 Analysis of variance of regression model for decolorization rate

表 5 DPPH自由基清除保持率為響應值的回歸方程方差分析表Table 5 Analysis of variance of regression model for retention rate of DPPH radical scavenging activity

2.3.2 響應面分析結果

圖 8 各因素交互作用的響應面圖Fig.8 Response surface plots for the effects of three factors and their interactions on the decolorization effi ciency and the retention rate of DPPH radical scavenging activity

由圖8可知，隨酶解液初始pH值增加，脫色率和DPPH自由基清除保持率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，最佳pH值在7.0左右，同時隨脫色劑用量的增加和酶解液質量濃度的降低脫色率不斷增加而DPPH自由基清除保持率不斷下降。

2.3.3 最佳酶解工藝的確定和驗證

因為實驗的最終目標是獲得同時具有較高DPPH自由基清除保持率和脫色率的脫色酶解液，通過Design-Expert分析獲得最佳脫色條件為脫色劑用量1.9%、質量濃度9.61 mg/mL的酶解液初始pH 7.2、水浴溫度60 ℃、振蕩轉速150 r/min、脫色時間1.0 h，系統(tǒng)預測DPPH自由基清除保持率為83.7%、脫色率為93.9%。采用該工藝條件進行實驗驗證，平行3次取平均值，得到DP PH自由基清除保持率為84.5%、脫色率為94.5%，與模型預測值基本相符，說明回歸方程可以應用于實踐。

2.4 脫色前后蠶蛹蛋白酶解液中各類氨基酸含量的比較

按照1.3.5節(jié)對脫色前后蠶蛹蛋白酶解液中各氨基酸成分進行分析，結果如表6所示，其中脫色前酶解液用SN1表示，脫色后酶解液用SN2表示。

表 6 脫色前后蠶蛹蛋白酶解液氨基酸組成Table 6 Amino acid composition of decolorized and non-decolorized hydrolyzate

從表6可以看出，SN1中疏水性氨基酸含量為49.2%，高于SN2的37.6%。其中脯氨酸（Pro）含量SN1為7.8%，高于SN2的7.4%；芳香族氨基酸（Trp、Phe、Tyr）含量SN1為19.2%，高于SN2的15.8%，不同氨基酸組分的改變，主要是因為脫色劑中堿性鈣基膨潤土在層間的羥基結構對酸性物質吸附能力較強產(chǎn)生選擇性吸附引起[26]。該結果與相關研究[27-30]具有疏水性氨基酸殘基或羧基端存在Pro、芳香族氨基酸殘基的多肽有較高抗氧化抑制活性的結論相符，該結論與實驗結果中DPPH自由基清除率SN1大于SN2的結論相一致。

3 結 論

以經(jīng)木瓜蛋白酶水解具有較高DPPH自由基清除率的蠶蛹蛋白酶解液為原料，確定選用活性白土、堿性鈣基膨潤土和膨潤土按照質量比1∶1∶1混合作為脫色劑進行脫色工藝研究，以脫色率和DPPH自由基清除保持率作為指標通過單因素和響應面試驗設計得酶解工藝條件為：脫色劑用量1.9%、酶解液質量濃度9.61 mg/mL的酶解液初始pH 7.2、水浴溫度60 ℃、振蕩轉速150 r/min、脫色時間1.0 h。在此條件下，DPPH自由基清除保持率為84.5%（DPPH自由基清除率為71.0%）、脫色率為94.5%，并通過實驗驗證其誤差值小于5%，說明采用響應面試驗設計方法對蠶蛹蛋白酶解體系進行優(yōu)化具有較好的可靠性。最后再對脫色前后酶解液中各氨基酸含量進行比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)脫色處理后酶解液中對DPPH自由基抑制有顯著影響的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸含量減少，該結論與實驗結果相符。

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Decolorization of Silkworm Pupae Protein Hydrolyzate with DPPH Radical Scavenging Activity

NONG Zhenni1,2, ZHAO Zhongxing1,*, WEI Tengyou1, QIN Huanhuan1, YANG Wu1
(1. Guangxi Institute of Science Experimental Center, Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of New Chemical Application Technology in Resources, School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2. College of Xiangsihu, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530008, China)

Papain hydrolyzate of silkworm pupae protein with DPPH radical scavenging activity was decolorized by the combined use of activated clay, alkaline Ca-bentonite and bentonite. Based on decolorization effi ciency and retention rate of radical scavenging activity, the decolorization conditions were optimized by using single-factor design and central composite design (CCD) coupled with response surface methodology (RSM). When the hydrolyzate with a concentration of 9.61 mg/mL and an initial pH of 7.2 was added with activated clay:alkaline Ca-bentonite:bentonite (1:1:1) in a proportion of 1.9% and incubated for 1.0 h in a thermostatically controlled water at 60 ℃ with shaking at a speed of 150 r/min, it retained 84.5% of its original DPPH radical scavenging activity and the decolorization rate was 94.5%, both close to the predicted values with a relative error less than 5%, suggesting the reliability of the developed response surface model. Comparing the amino acid composition of the decolorized hydrolyzate with that of the untreated one, it was found that the contents of hydrophobic and aromatic amino acids which are signifi cantly effective in inhibiting DPPH free radical were reduced after the decolorization treatment.

silkworm pupae protein; DPPH radical scavenging rate; decolorization; response surface methodology

TS201.2

A

1002-6630（2015）02-0012-07

10.7506/spkx1002-6630-201502003

2014-06-30

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401629）；廣西自然科學基金項目（2013GXNSFBA019031）；河池市科學研究與技術開發(fā)計劃項目（河科攻1489-1-6）

農珍妮（1980—），女，講師，碩士研究生，研究方向為生物化工。E-mail：164293010@qq.com

*通信作者：趙鐘興（1979—），男，副教授，博士，研究方向為生物化工。E-mail：zzxx@gxu.edu.cn