卓 納張 滿辛 燕

·論著·

內(nèi)蒙古漢族人群維生素D受體FokI基因多態(tài)性與斑禿的關(guān)系

卓 納1張 滿1辛 燕2?

目的: 明確維生素D受體FokI基因多態(tài)性與內(nèi)蒙古漢族人群斑禿的相關(guān)性。方法: 運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR－RFLP)技術(shù)，檢測(cè)105例斑禿患者與145名健康對(duì)照的維生素D受體基因FokI酶切位點(diǎn)的多態(tài)性。結(jié)果: 病例組維生素D受體FokI的3種基因型FF、Ff、ff頻率分別為0.324、0.524、0.152，對(duì)照組分別為0.297、0.531、0.172，兩組間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論: 維生素D受體FokI基因多態(tài)性可能與內(nèi)蒙古漢族人群斑禿的發(fā)病無(wú)關(guān)。

斑禿； 維生素D受體； FokI基因多態(tài)性

斑禿是一種臨床常見(jiàn)皮膚病，我國(guó)的患病率為0.27%。1典型表現(xiàn)為頭部出現(xiàn)單個(gè)或數(shù)個(gè)邊界清晰的圓形脫發(fā)斑。斑禿對(duì)患者的心理和生活質(zhì)量均有影響。

維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)啟動(dòng)毛發(fā)生長(zhǎng)周期，保證各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路正常進(jìn)行并促進(jìn)毛囊干細(xì)胞增殖與分化，在毛發(fā)生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。2－5近年來(lái)學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，6斑禿患者毛囊VDR的mRNA和蛋白表達(dá)均降低。VDR的活性和數(shù)量直接受VDR基因的調(diào)控，VDR基因的改變直接影響VDR生物學(xué)功能的實(shí)現(xiàn)。FokI作為與個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的VDR的基因多態(tài)性位點(diǎn)之一，其異?？蓪?dǎo)致VDR生物學(xué)功能的改變。本研究觀察正常對(duì)照組及斑禿患者VDR FokI基因多態(tài)性的差異，以探討VDR FokI基因多態(tài)性與斑禿的相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 入選對(duì)象來(lái)自?xún)?nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院、內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院及內(nèi)蒙古北方重工醫(yī)院皮膚科就診的斑禿患者105例(男57例，女48例)。入選標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)臨床確診的斑禿患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)選自O(shè)lsen等7制定的斑禿臨床診斷指南，入選前2個(gè)月內(nèi)未接受全身糖皮質(zhì)激素、免疫制劑和放射治療，排除其他類(lèi)型脫發(fā)，如先天性脫發(fā)、生長(zhǎng)期脫發(fā)、雄激素源性脫發(fā)以及瘢痕性脫發(fā)。排除伴發(fā)有與VDR FokI基因多態(tài)性相關(guān)的如骨質(zhì)疏松、佝僂病、鉛中毒、前列腺癌、乳腺癌、尿結(jié)石等疾病。

病例組患者105例，男57例，女48例，年齡4～66歲，平均35.56±11.82歲。對(duì)照組為健康體檢人群145名，男75名，女70名，年齡7～64歲，平均37.14± 13.64歲，性別和年齡與病例組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與患者無(wú)親屬關(guān)系，所有健康人群經(jīng)病史詢(xún)問(wèn)及體格檢查后排除患病。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 取外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，采用鹽析法進(jìn)行基因組DNA提取。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 引物序列:上游引物(P1):5′－AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT－3′；下游引物(P2):5′－ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC－3′。

1.2.3 PCR擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)體系總體積20 μL，DNA模板(150 ng)2 μL，TaqDNA聚合酶(0.5U)0.5 μL，緩沖液10 μL，dNTP 2 μL，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL無(wú)菌去離子水3.5 μL。

PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min，94℃變性，25 s；復(fù)性62℃，35 s；延伸72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，最后延伸10 min。

1.2.4 酶切體系及其反應(yīng)條件 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，1 μL FokI限制性?xún)?nèi)切酶，10×Buffer緩沖液、0.1 BSA緩沖2 μL，去離子水5 μL，37℃水浴3 h。

1.2.5 電泳及結(jié)果分析 將2%瓊脂糖凝膠放入水平電泳槽中，加入足量的l×TBE電泳緩沖液，取20 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入到2%瓊脂糖凝膠的上樣孔。90伏恒壓電泳，30 min后在紫外凝膠成像分析儀上照相并作標(biāo)記和存檔。分型標(biāo)準(zhǔn):FF型為265 bp一個(gè)片段；Ff型為265 bp，196 bp，69 bp三個(gè)片段；基因型ff為196 bp，69 bp兩個(gè)片段。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)采用SPSS 16.0軟件分析。判讀樣本基因型并計(jì)算組內(nèi)基因型例數(shù)，先用Hardy－Weinberg平衡原理估測(cè)樣本的群體代表性，再統(tǒng)計(jì)各組FokI的基因型及等位基因頻率，組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果 經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶FokI對(duì)PCR產(chǎn)物消化后電泳，顯示維生素D受體存在多態(tài)性。VDR基因有2個(gè)等位基因F和f，可組合形成FF、Ff、ff 3種基因型，見(jiàn)圖1。

2.2 Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn) 病例組與對(duì)照組VDR FokI基因多態(tài)性位點(diǎn)經(jīng)Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(均P＞0.05)。這表明，本研究選取的病例組和對(duì)照組個(gè)體能夠代表總體基因型分布規(guī)律，見(jiàn)表1。

表1 病例組與對(duì)照組VDR FokI基因多態(tài)性Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

2.3 維生素D受體基因FokI基因型和等位基因頻率分布 病例組VDR FokI基因型和等位基因分布與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，見(jiàn)表2、表3。

圖1 VDR基因FokI位點(diǎn)酶切電泳結(jié)果

表2 病例組與對(duì)照組VDR FokI基因型分布頻率比較

3 討論

維生素D(vitamin D，VitD)為人體必須的一種維生素，為一組脂溶性類(lèi)固醇衍生物，在紫外線和飲食的影響下在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中合成，直接或間接調(diào)節(jié)腎及腸道鈣、磷代謝，組織細(xì)胞增殖、分化和凋亡。這些功能的發(fā)揮主要通過(guò)VDR介導(dǎo)。VDR是核受體，廣泛存在于骨骼、腎、腸道、皮膚等體內(nèi)大多數(shù)組織和細(xì)胞，調(diào)控機(jī)體新陳代謝，也存在于毛囊角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮乳頭細(xì)胞，調(diào)控皮膚新陳代謝和毛囊生長(zhǎng)周期。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，VDR在斑禿的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，其活性與數(shù)量的改變直接影響斑禿的發(fā)生和發(fā)展。斑禿患者毛囊VDR的mRNA和蛋白表達(dá)均降低，分析其原因可能為以下幾點(diǎn):(1)VDR使角質(zhì)形成細(xì)胞增殖減慢，分化加快。缺少VDR會(huì)減慢角質(zhì)形成細(xì)胞的分化和毛囊的生長(zhǎng)，進(jìn)而發(fā)生脫發(fā)；5(2)正常足量的VDR缺乏時(shí)，阻止β－連環(huán)蛋白與Lef1合，Wnt信號(hào)通路阻斷，導(dǎo)致毛囊發(fā)育異常；8(3)結(jié)合部位VDR DNA的缺少導(dǎo)致毛發(fā)生長(zhǎng)周期啟動(dòng)缺陷，導(dǎo)致生長(zhǎng)期毛發(fā)減少，進(jìn)而脫發(fā)；9(4)VDR敲除小鼠的 T細(xì)胞發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)，學(xué)者們推測(cè)，VDR的減少誘導(dǎo)毛囊發(fā)生炎癥反應(yīng)，使毛囊提前進(jìn)入退行期，從而發(fā)生脫發(fā)。10

VDR基因調(diào)控VDR mRNA和蛋白表達(dá)，VDR的編碼基因位于常染色體12q，全長(zhǎng)約75 kb，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成。VDR有多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，與個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育及人類(lèi)疾病相關(guān)的基因多態(tài)性有4個(gè)，分別對(duì)應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶 FokI、BsmI、ApaI、TaqI的酶切位點(diǎn)。FokI內(nèi)切酶多態(tài)性位點(diǎn)位于VDR基因第2外顯子，BsmI、ApaI內(nèi)切酶多態(tài)性位點(diǎn)位于第8和第9外顯子之間的內(nèi)含子內(nèi)，TaqI位于第9外顯子中。這些內(nèi)切酶多態(tài)性都可以影響VDR蛋白的數(shù)量和活性。

研究發(fā)現(xiàn)，VDR FokI基因多態(tài)性因人種和地區(qū)的不同出現(xiàn)不同多態(tài)性分布。FokI等位基因分布頻率在我國(guó)漢族人群中的頻率分布為F 47%，f 53%，在瑞士高加索人群為F 59%，f 40%，在日本人群中為F 62%，f 37%。鄭敏等11報(bào)道的廣西地區(qū)兒童VDR FokI基因型頻率為FF 29.85%、Ff 48.13%和ff 22.02%。盛開(kāi)妍等12報(bào)道，我國(guó)上海地區(qū)漢族人口中FF、Ff和ff基因型頻率為40%、48.13%和11.88%。于利偉等13報(bào)道的西安地區(qū)漢族人口VDR FokI基因型頻率為FF 59%、Ff 30%和ff 11%。我們的結(jié)果中VDR FokI基因型頻率為FF 29.7%，F(xiàn)f 53.1%，ff 17.2%，與鄭敏等報(bào)道的廣西地區(qū)基因型分布頻率接近，與盛開(kāi)妍等報(bào)道的上海地區(qū)、于利偉等報(bào)道的西安地區(qū)分布頻率略有不同。

我們的研究顯示，內(nèi)蒙古地區(qū)漢族人群VDR基因FokI基因多態(tài)性與斑禿無(wú)相關(guān)性，這與Akar等14對(duì)土耳其白種人25例斑禿和27例對(duì)照組進(jìn)行的研究結(jié)果相一致。

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(收稿:2014－08－14 修回:2014－08－24)

Relationship between vitamin D receptor gene FokI polymorphism and alopecia areata in Inner Mongolian Han population

ZHUO Na，ZHANG Man，XIN Yan.Affiliated Hospital of Inner Mongolian Medical University，Inner Mongolian，Hohhot，010050

Objective:To determine the relationship between the polymorphism of vitamin D receptor gene FokI and alopecia areata in Inner Mongolia Han population.Methods:The polymorphism of vitamin D receptor Gene FokI sites in patients with alopecia areata(105 patients)and healthy controls(145 patients)were detected by PCR－RELP.Results:The genotype frequencies of FF，F(xiàn)f and ff in patients were 0.324，0.524，0.152 and those in healthy controls were 0.297，0.531，0.172.There were no significant difference between the patients and the controls(P＞0.05).Conclusion:There is no relationship between the polymorphism of vitamin D receptor FokI and alopecia areata in Inner Mongolia Han population.

alopecia areata；vitamin D receptor；FokI polymorphism

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，內(nèi)蒙古呼和浩特，010050 2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚科，內(nèi)蒙古包頭，014010

?通信作者