唐 健，李煦田，梁鳳嬌，張 敏，馬立軍

(華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣州510006)

人體細(xì)胞內(nèi)的pH 值對(duì)一系列生理活動(dòng)有著極其重要的影響［1］，例如細(xì)胞的增殖與凋亡［2］、離子運(yùn)輸［3］、神經(jīng)信號(hào)傳遞［4］、肌肉收縮［5］等. 正常情況下人體血液的pH 值為7.4 ±0.5，過(guò)酸或者過(guò)堿都會(huì)影響正常的生理功能并導(dǎo)致疾病的發(fā)生，例如癌癥［6］和阿爾茨海默綜合癥［7］. 因此研究和監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH 值的變化對(duì)生理活動(dòng)的影響有著重要的意義［8］.

與傳統(tǒng)的檢測(cè)pH 值方法如指示劑法、電極法相比［9］，熒光光譜法是以光信號(hào)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，它具有實(shí)時(shí)、原位、高靈敏度、高選擇性、快速響應(yīng)、對(duì)樣品無(wú)破壞等優(yōu)點(diǎn)［10］，因此能應(yīng)用于細(xì)胞等生物體系的pH 值檢測(cè). 近年來(lái)，許多新型的pH 熒光探針被報(bào)道. Song 等［11］合成了一種具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光增強(qiáng)的比率型pH 熒光探針，由于C—N 鍵分子內(nèi)自由內(nèi)旋轉(zhuǎn)及非平面構(gòu)型的限制，在聚集/固態(tài)中顯示聚集誘導(dǎo)發(fā)光增強(qiáng)，并且該探針能在活細(xì)胞中對(duì)pH 5.0～7.0 有檢測(cè)響應(yīng). Liu 等［12］合成了一種香豆素－吲哚基的近紅外比率型pH 熒光探針，得益于較大的Stokes 位移，該探針具有快速響應(yīng)和高靈敏度特性，在pH 2.0～7.0 有響應(yīng)，并且能應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)酸性環(huán)境的檢測(cè). 1968年，Ghosh 和Whitehose［13］第一次提出以4-氯-7-硝基苯并呋咱作為一種氨基化合物的衍生試劑，并與其它親核試劑反應(yīng)產(chǎn)生熒光. 此類(lèi)探針含有推電子氨基和強(qiáng)拉電子的硝基，可增強(qiáng)分子內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移，又有羥基和氮?dú)潢庪x子的結(jié)合點(diǎn)，對(duì)陰離子的識(shí)別有很強(qiáng)的能力.本文將水溶性良好的色氨酸與苯并呋咱結(jié)合，合成了一種水溶性好的7-硝基苯并呋咱色氨酸(簡(jiǎn)稱(chēng)FSS)，研究發(fā)現(xiàn)該探針能夠在水溶液中對(duì)OH－表現(xiàn)出高選擇性的熒光識(shí)別效應(yīng)，表現(xiàn)為一種堿性熒光探針.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

儀器:熒光分光光度計(jì)(HITACHI F-2500 FL Spectrophotometer)，溶液樣品所采用的激發(fā)波長(zhǎng)均為470 nm;紫外－可見(jiàn)分光光譜儀(SHIMAZU UV-1700 UV-vis spectrometer);核磁共振波譜儀(Varian NMR Systems 400 MHz spectrometer);質(zhì)譜儀(LCQ Deca XP MAX)液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀;pH 計(jì)(上海精密雷磁PHS-3B 酸度計(jì)).

試劑:三乙胺、無(wú)水甲醇、4-氯-7-硝基苯并呋咱(簡(jiǎn)稱(chēng)物質(zhì)A)、色氨酸、無(wú)水硫酸鎂、二氯甲烷、乙酸乙酯、氫氧化鈉、鹽酸、去離子水.

1.2 探針的合成與表征

7-硝基－苯并呋咱－色氨酸(FSS)的合成路線如圖1 所示，首先將色氨酸進(jìn)行酯化生成色氨酸甲酯鹽酸鹽，然后將其與4-氯-7-硝基苯并呋咱化合獲得7-硝基－苯并呋咱－色氨酸甲酯(簡(jiǎn)稱(chēng)FSZ)，最后FSZ 水解生成探針FSS.

1.2.1 色氨酸甲酯鹽酸鹽的合成 色氨酸甲酯鹽酸鹽的合成參照文獻(xiàn)［14］，合成后應(yīng)立即進(jìn)行下一步的反應(yīng).

1.2.2 FSZ 的合成 將色氨酸甲酯鹽酸鹽溶于30.0 mL 甲醇中，冰鹽浴下冷卻5.0 min 后，向其中緩慢滴加0.1 mL 的三乙胺，繼續(xù)冷卻攪拌30.0 min. 用恒壓漏斗將溶于甲醇的4-氯-7-硝基苯并呋咱緩慢滴加到上述冷卻液中，溶液變?yōu)樽厣? 放于室溫下攪拌反應(yīng)20.0 h 后，抽濾并蒸干溶劑得到深棕色的粗產(chǎn)物. 然后用二氯甲烷溶解粗產(chǎn)物，并用去離子水洗至水層呈中性，以除去三乙胺. 有機(jī)層用無(wú)水硫酸鎂干燥、抽濾，將濾液蒸干，將此粗產(chǎn)物用乙酸乙酯作展開(kāi)劑進(jìn)行硅膠柱層析分離. 過(guò)柱分離后得到棕色的固體產(chǎn)物FSZ.

1.2.3 FSS 的合成 將FSZ 溶于60.0 mL 的0.1 mol/L NaOH 水溶液中，室溫下攪拌30.0 min 后，F(xiàn)SZ 全部溶解. 用乙酸乙酯萃取5 次以除去未反應(yīng)的FSZ 和一些可能的副產(chǎn)物. 水相(棕色)中加入0.5 mol/L 鹽酸至弱酸性(pH≈5.5)，萃取液經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥后抽濾，蒸干溶劑. 用乙酸乙酯作展開(kāi)劑進(jìn)行硅膠柱層析分離，過(guò)柱分離后得到深棕色固體產(chǎn)物FSS.

化合物FSS 的1H-NMR 譜(500 MHz，CDCl3)中化學(xué)位移和對(duì)應(yīng)的質(zhì)子類(lèi)型歸屬為:8.18～6.860(m，6H，indole(H))，6.932、5.173(s，2H，benzoxadiazole(H))，5.866(s，1H，—NH—)，4.595(s，1H，—CH)，3.508～3.247(m，2H，—CH2—). 理論計(jì)算的相對(duì)分子質(zhì)量(C17H13N5O5)為367.32，實(shí)際測(cè)試中質(zhì)荷比為366.10 為FSS 去質(zhì)子化所形成的質(zhì)譜峰.

圖1 FSS 的合成路線Figure 1 Synthetic route of FSS

1.3 測(cè)試溶液的配制

將FSS 溶于DMSO 中，配制成濃度為2.0 mmol的母液，用固體NaOH 和去離子水配制成0.1 mol/L的堿性水溶液. 取30.0 μL 的FSS 母液加入到3.0 mL 的離心管中，配制成濃度為20.0 μmol 的含5%DMSO(體積分?jǐn)?shù))的水溶液. 用上述0.1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)體系的pH 值，再進(jìn)行相應(yīng)的光譜測(cè)試.

2 結(jié)果與討論

2.1 探針FSS 對(duì)OH－響應(yīng)的紫外－可見(jiàn)光譜

如圖2 所示，F(xiàn)SS 的紫外－可見(jiàn)光譜在pH 為7.94 時(shí)出現(xiàn)2個(gè)吸收峰(480 和350 nm 處)，它們?yōu)楸讲⑦辉鄣奶卣魑辗? pH 從7.94 到12.24 過(guò)程中，480 nm 處的吸收峰強(qiáng)度下降，并出現(xiàn)藍(lán)移，與此同時(shí)350 nm 處的吸收峰強(qiáng)度不斷增大，伴隨著紅移現(xiàn)象，當(dāng)pH 最終達(dá)到11.39 后，此探針僅在390 nm處存在一個(gè)新的吸收峰. 整個(gè)pH 變化過(guò)程中，在440 nm 處出現(xiàn)一個(gè)等吸收點(diǎn). 同時(shí)，溶液的顏色從pH 為7.94 時(shí)的橙紅色變成pH 為12.24 時(shí)的黃色，pH 為10.18 是橙紅色到黃色的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，并且隨著pH 的增大，黃色不斷加深(圖2 插圖). 產(chǎn)生這種變化的原因可能是隨著溶液堿性的增強(qiáng)，F(xiàn)SS 分子上的亞氨基發(fā)生去質(zhì)子化作用，使得苯并呋咱芳香環(huán)的電子云密度發(fā)生改變，從而導(dǎo)致光吸收性質(zhì)發(fā)生明顯的改變，同時(shí)在溶液的顏色上發(fā)生變化.

圖2 不同pH 下FSS 的紫外－可見(jiàn)光譜和顏色變化Figure 2 UV-vis spectra and color transformation of FSS at different pHs

從FSS 的紫外－可見(jiàn)吸收光譜(圖2)可明顯看出，隨著pH 的增加，480 nm 處的吸收峰逐漸下降，同時(shí)390 nm 處的峰不斷增加，導(dǎo)致FSS 對(duì)堿性pH表現(xiàn)出比率型變化規(guī)律(圖3)，在390 和480 nm 處吸收峰強(qiáng)度的比值Ⅰ390/Ⅰ480，能夠?qū)θ芤旱乃釅A度表現(xiàn)出不同的比值響應(yīng). 在pH ＜9.57 時(shí)，Ⅰ390/Ⅰ480基本不變;當(dāng)pH ＞9.57 時(shí)，其比值不斷增大，Ⅰ390/Ⅰ480能夠作為堿性條件下pH 的響應(yīng)信號(hào).

圖3 不同pH 下Ⅰ390/Ⅰ480的變化趨勢(shì)Figure 3 Change tendency of Ⅰ390/Ⅰ480 at different pHs

2.2 探針FSS 對(duì)OH－的熒光識(shí)別

在470 nm 波長(zhǎng)光的激發(fā)下，F(xiàn)SS 的水溶液在546 nm 處有較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰(圖4)，隨著pH 值的不斷增大，F(xiàn)SS 的熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯變化，在pH為7.94～9.26 時(shí)FSS 的熒光強(qiáng)度基本不變，當(dāng)pH為9.57～12.24 時(shí)，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)明顯規(guī)律性的猝滅變化. 當(dāng)pH 達(dá)到12.24 時(shí)，F(xiàn)SS 的熒光峰的強(qiáng)度下降了70.8%，表現(xiàn)出熒光猝滅響應(yīng)信號(hào). 產(chǎn)生這種變化的原因可能是在堿性條件下，F(xiàn)SS 分子中苯并呋咱芳香環(huán)上的亞氨基發(fā)生了去質(zhì)子化作用，由于苯并呋咱環(huán)上存在吸電子的硝基產(chǎn)生電子推拉效應(yīng)，使得苯并呋咱環(huán)上的電子云密度發(fā)生較大改變，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱［15］. 因此，堿性條件下FSS 對(duì)pH具有熒光猝滅響應(yīng)識(shí)別作用，熒光峰強(qiáng)度發(fā)生變化.

圖4 不同pH 下FSS 的熒光光譜Figure 4 Fluorescence emission spectra of FSS at different pHs

根據(jù)pKa=pH +lg［(Fmax－F)/(F－Fmin)］［16］計(jì)算出FSS 的pKa(圖5)，F(xiàn)SS 的pKa為10.64. 結(jié)果說(shuō)明，F(xiàn)SS 在堿性pH 范圍內(nèi)能很好地檢測(cè)溶液的pH 值，F(xiàn)SS 可作為一種對(duì)OH－有識(shí)別作用的靈敏的“熒光猝滅型”pH 探針.

2.3 FSS 熒光響應(yīng)的可逆性

熒光探針的可逆性也被檢測(cè)，在上述強(qiáng)堿性FSS 溶液中滴加鹽酸調(diào)整pH 值使之逐漸變小，同時(shí)測(cè)試FSS 的熒光發(fā)射光譜. 隨著pH 從強(qiáng)堿性到弱堿性的逐漸變化，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在pH 為9.57時(shí)其熒光強(qiáng)度基本與初始測(cè)試狀態(tài)的熒光強(qiáng)度保持一致，并且溶液的顏色也從黃色變回橙紅色. 這樣的結(jié)果說(shuō)明FSS 對(duì)pH 的響應(yīng)具有可逆性.

圖5 FSS 的最大熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度與pH 值的關(guān)系以及pKaFigure 5 Intensity of the strongest fluorescence emission peak of FSS at different pHs and pKa

3 結(jié)論

采用色氨酸與4-氯-7-硝基苯并呋咱合成了一種水溶性良好的熒光探針——7-硝基苯并呋咱色氨酸(FSS)，并表征了它的結(jié)構(gòu). 通過(guò)測(cè)試紫外－可見(jiàn)光譜和熒光發(fā)射光譜，發(fā)現(xiàn)FSS 在堿性條件下對(duì)水溶液的pH 值表現(xiàn)出紫外光譜的比率型變化和熒光猝滅型雙重識(shí)別響應(yīng)，并且顏色有明顯的從橙紅到黃的轉(zhuǎn)變.計(jì)算得到pKa為10.64，說(shuō)明它能應(yīng)用于堿性pH 的檢測(cè)，同時(shí)它也能夠用于pH 值的重復(fù)測(cè)量，是一種堿性pH 值探針.

［1］Roos A，Boron W F. Intracellular pH［J］. Physiological Reviews，1981，61(2):296－434.

［2］Casciari J J，Sotirchos S V，Sutherland R M. Variations in tumor cell growth rates and metabolism with oxygen concentration，glucose concentration，and extracellular pH［J］. Journal of Cellular Physiology，1992，151(2):386－394.

［3］Mobasheri A，Mobasheri R，F(xiàn)rancis M J O，et al. Ion transport in chondrocytes:Membrane transporters involved in intracellular ion homeostasis and the regulation of cell volume，free［Ca2+］and pH［J］. Histology and Histopathology，1998，13(3):893－910.

［4］Kaplan D R，Miller F D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system［J］. Current Opinion in Neurobiology，2000，10(3):381－391.

［5］Waddell W J，Butler T C. Calculation of intracellular pH from the distribution of 5，5-dimethyl-2，4-oxazolidinedione (DMO). Application to skeletal muscle of the dog［J］. Journal of Clinical Investigation，1959，38(5):720－729.

［6］Webb B A，Chimenti M，Jacobson M P，et al. Dysregulated pH:A perfect storm for cancer progression［J］. Nature Reviews Cancer，2011，11(9):671－677.

［7］Davies T A，F(xiàn)ine R E，Johnson R J，et al. Non-age related differences in thrombin responses by platelets from male patients with advanced Alzheimer's Disease［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications，1993，194(1):537－543.

［8］Plette A C C，van Riemsdijk W H，Benedetti M F，et al.pH dependent charging behavior of isolated cell walls of a gram-positive soil bacterium［J］. Journal of Colloid and Interface Science，1995，173(2):354－363.

［9］蘇美紅，聶麗華，馬會(huì)民. pH 熒光探針的研究進(jìn)展［J］. 分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(2):210－214.Su M H，Nie L H，Ma H M. Progress of pH fluorescence probes［J］. Journal of Analytical Science，2005，21(2):210－214.

［10］馬立軍.基于氨基酸的重金屬離子熒光探針的設(shè)計(jì)、合成、及識(shí)別機(jī)理［D］. 長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2008.

［11］Song P，Chen X，Xiang Y，et al. A ratiometric fluorescent pH probe based on aggregation-induced emission enhancement and its application in live-cell imaging［J］.Journal of Materials Chemistry，2011，21(35):13470－13475.

［12］Liu X D，Xu Y，Sun R，et al. A coumarin-indole-based near-infrared ratiometric pH probe for intracellular fluorescence imaging［J］. Analyst，2013，138(21):6542－6550.

［13］Ghosh P B，Whitehouse M W. Potential antileukemic and immunosuppressive drugs. Preparation and in vitro pharmacological activity of some 2，1，3-benzoxadiazoles(benzofurazans)and their N-oxides (benzofuroxans)［J］.Journal of Medicinal Chemistry，1968，11(2):305－311.

［14］李洪偉.基于磺酰胺基團(tuán)的汞離子熒光探針的設(shè)計(jì)、合成及識(shí)別機(jī)理研究［D］.長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2009.

［15］Jiang W，F(xiàn)u Q，F(xiàn)an H，et al. A highly selective fluorescent probe for thiophenols［J］. Angewandte Chemie，2007，119(44):8597－8600.

［16］Bissell R A，de Silva A P，Gunaratne H Q N，et al. pKawas calculated by the equation:pKa=pH +lg［(Fmax－F)/(F－Fmin)］［J］. Chemical Society Reviews，1992，21:187－195.