白 鴿，郭玉蓉*，陳 磊，張曉瑞

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

蘋果著色與冷藏期間多酚及相關(guān)酶活性的關(guān)系

白 鴿，郭玉蓉*，陳 磊，張曉瑞

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

利用紅色面積不小于80%和紅色面積大不于20%的‘富士’蘋果為材料，分析2種樣品在冷藏期間品質(zhì)、多酚及相關(guān)酶活性的變化，測定冷庫貯藏期間蘋果的理化指標(biāo)、總酚含量及其苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）活性變化，并用高效液相色譜檢測蘋果多酚組成成分變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果實(shí)貯藏過程中硬度持續(xù)下降，可溶性固形物含量和pH值持續(xù)升高；總多酚含量變化趨勢為下降-升高-下降，多數(shù)單體酚含量變化與總多酚含量變化一致，且二者含量均在貯藏第100天時(shí)達(dá)到峰值；PAL活性在貯藏第100天時(shí)出現(xiàn)峰值，而PPO活性峰值則出現(xiàn)在貯藏第50天時(shí)，POD活性在貯藏第150天時(shí)出現(xiàn)峰值，3 種酶活性的變化與多酚含量變化是密切相關(guān)的。結(jié)果表明，‘富士’蘋果進(jìn)行冷庫貯藏，貯藏第100天左右時(shí)營養(yǎng)價(jià)值最高，達(dá)到最佳食用時(shí)期。

蘋果；冷庫貯藏；理化指標(biāo)；酶活性；多酚

蘋果是世界四大水果之一，深受消費(fèi)者的喜愛[1]，在世界果品市場占有重要地位[2]。蘋果種植過程中由于田間管理不同，造成蘋果著色出現(xiàn)很大差異，進(jìn)而影響蘋果貯藏品質(zhì)和多酚含量。蘋果中富含的多酚類物質(zhì)，包括種類繁多的酚酸類和類黃酮類[3-4]，對人體保持健康具有重要的作用。大量的研究[5-8]顯示蘋果多酚具有多種藥理功能如抗癌、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、保護(hù)軟骨與增強(qiáng)骨質(zhì)、生發(fā)與烏發(fā)、保護(hù)視網(wǎng)膜、抗視力退化、抗菌、抗病毒、抗過敏、防齲齒、防輻射、防治冠心病與中風(fēng)等心腦血管疾病，其許多生理功能活性比茶多酚要高100 倍以上[9]。由于我國在蘋果種植方面以晚熟的‘富士’系為主，漸漸地決定了國內(nèi)蘋果消費(fèi)以‘富士’為主，并間接 導(dǎo)致我國蘋果市場“早熟奇缺，中熟不足，晚熟過剩”的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)[10-11]。果實(shí)采后多酚的含量變化除了受內(nèi)部相關(guān)酶活性、成熟度、色澤的影響外，還受外部因素影響，如低溫、1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）、CO2體積分?jǐn)?shù)[12]等。因此，對晚熟‘富士’蘋果進(jìn)行貯藏，以持續(xù)供應(yīng)市場，且市場貯藏前半期以冷庫貯藏為主，后半期的市場供應(yīng)則以氣調(diào)庫蘋果為主。

本實(shí)驗(yàn)以宜川晚熟‘富士’蘋果為實(shí)驗(yàn)材料，研究其在采后冷藏期間多酚及其相關(guān)酶活性的變化，并分析各項(xiàng)檢測指標(biāo)之間的相關(guān)性，旨在了解蘋果在貯藏過程中果實(shí)品質(zhì)變化規(guī)律、多酚和酶活性的變化特點(diǎn)，以期彌補(bǔ)前人未將酶活性與多酚單體含量變化共同分析的空白，并為‘富士’蘋果的貯藏、保鮮、銷售和食用提供理論參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)于2013—2014年在陜西華圣果業(yè)有限公司貯藏室和陜西師范大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試材選定陜西省宜川縣，一個(gè)管理良好的農(nóng)家果園的‘富士’蘋果，并按照蘋果果皮著色程度將其分成2組：紅色面積不小于80%記為顏色好的蘋果；紅色面積不大于20%記為顏色差的蘋果，放入華圣果業(yè)的冷庫進(jìn)行貯藏（±0.5 ℃），貯藏期間完全按照華圣果業(yè)貯藏條件進(jìn)行管理。每 50 d取1 次樣，共取5 次樣，每次每組20 個(gè)果實(shí)，取出后立即用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室，其中10 個(gè)‘富士’果實(shí)進(jìn)行理化指標(biāo)測定，剩下10 個(gè)果實(shí)皮（厚度約0.5 mm）、肉分開后，分別放入—80 ℃冰箱貯藏，用以后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

甲醇（色譜純） 美國Fisher Scientific公司；綠原酸、表兒茶素、金絲桃苷、蘆丁、根皮苷、槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純） 美國Sigma公司。

FT-327硬度計(jì) 意大利 Breuzzi公司；B225581糖度計(jì) 日本Atago公司；雷磁PHS-3CpH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；TGL-16G高速低溫離心機(jī) 上海安亭公司；超聲波儀器 昆山市超聲儀器有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；超高效液相色譜液相分析系統(tǒng) 美國Dionex公司；高效液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m） 美國Dikma公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果理化指標(biāo)的測定[2]

果實(shí)硬度測定：在每個(gè)蘋果肩部均勻選擇3 個(gè)位置，用FT-327硬度計(jì)測定（11 mm），取平均值；可溶性固形物含量和pH值測定：八分法取蘋果果肉榨汁，用糖度計(jì)測定可溶性固形物含量；用pH計(jì)測定pH值。

1.3.2 總多酚含量及組成測定

1.3.2.1 總多酚含量測定

果皮多酚測定參照孫建霞[13]的方法稍加改動(dòng)。用液氮分別研磨樣品，按料液比1∶4（g/mL）加入65%乙醇溶液58 ℃水浴35 min，將提取液在4 ℃、12 000 r/min離心10 min取上清液。取1.0 mL上清液加入12 mL飽和Na2CO3和1.0 mL福林酚溶液，定容至25 mL。室溫避光反應(yīng)1 h后，檢測OD765nm值。

總酚含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用5 mL 70%乙醇溶液溶解0.25 g沒食子酸，定容至50 mL，分別移取0.5、1.0、1.5、2.5、5.0 mL至容量瓶中，用去離子水定容50 mL，制備質(zhì)量濃度分別為50、100、150、250、500 mg/L的沒食子酸溶液。從上述不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別移取0.5 mL加入到50 mL容量瓶中后分別加入30 mL去離子水，混勻，加入2.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混勻后，加入7.5 mL 20%碳酸鈉溶液，混合，定容。室溫避光反應(yīng)1 h后，檢測OD765nm值，從而得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將測得的OD765nm值代入所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可換算出總多酚的沒食子酸當(dāng)量值。

1.3.2.2 多酚組成測定

果皮用液氮研磨成粉末，按照料液比1∶4（g/mL）加入65%乙醇溶液，58 ℃水浴浸提35 min。將提取液在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.45 ?m的濾膜過濾后，取400 μL轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中等待進(jìn)樣。Dionex UPLC液相分析系統(tǒng)和Dikma HPLC柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；溶液A（甲醇）和溶液B（3‰三氟乙酸）。利用溶液B進(jìn)行梯度洗脫：0～10 min，80% B；12～20 min，78% B；22～40 min，68% B；42～50 min，60% B；52～70 min，55% B；72 min，50% B；80 min，45% B；88～95 min，80% B。柱溫30 ℃；流動(dòng)相速率：1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。在280 nm波長進(jìn)行多酚組成的檢測，記錄出峰時(shí)間，和綠原酸、表兒茶素、金絲桃苷、蘆丁、根皮苷、槲皮苷6 種多酚單體標(biāo)品進(jìn)行比對鑒定多酚的成分。同時(shí)，在得到液相圖譜之后，以對應(yīng)峰面積的積分值來表示相應(yīng)多酚單體的含量。

1.3.3 苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）活性測定

參照林植芳等[14]的方法。每次用蒸餾水洗凈實(shí)驗(yàn)果，用濾紙吸干表面水分，粉碎后取0.50 g果肉，加入5 mL 0.05 mol/L pH 8.8的硼酸緩沖液（內(nèi)含0.005 mol/L β-巰基乙醇），然后加入0.10 g聚乙烯吡咯烷酮和少許石英砂，冰浴條件下研磨成勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清液為酶液，測定PAL活性。

酶活性測定反應(yīng)體系：0.02 mol/L L-苯丙氨酸（用0.1 mol/L、pH 8.8的硼酸緩沖液配制）1.0 mL，0.05 mol/L硼酸緩沖液2.0 mL，1.0 mL酶液，30 ℃水浴30 min，在290 nm處測定OD290nm值。每克鮮質(zhì)量每分鐘所引起光密度值變化 0.0l為一個(gè)酶活力單位。

1.3.4 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性測定

酶液的制備：取3.0 g 果肉樣品，加2 mL 100 mmol/L pH 5.5的醋酸緩沖溶液，冰浴研磨勻漿，在4 ℃、14 000 r/min離心30 min，取上清液作為酶液，測定PPO活性[15-16]。

PPO活性檢測：反應(yīng)體系為2 mL 50 mmol/L pH值為5.5的醋酸緩沖溶液、0.6 mL 1 mol/L 鄰苯二酚溶液、0.2 mL 酶液；從加入酶液1 min開始，記錄每分鐘反應(yīng)體系在420 nm 波長的光密度值，連續(xù)測定2 min。以每分鐘內(nèi)反應(yīng)體系在420 nm波長處的光密度值ΔOD420nm為一個(gè)酶活單位U。

POD活性檢測：反應(yīng)體系為2.6 mL 25 mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液、0.2 mL 250 mmol/L 過氧化氫溶液、0.4 mL 酶液；從加入酶液1 min開始，記錄每分鐘反應(yīng)體系在470 nm 波長的光密度值，連續(xù)測定2 min。以每分鐘內(nèi)反應(yīng)體系在470 nm波長處的ΔOD470nm為一個(gè)酶活單位U。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次以上，使用SPSS 18.0數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性分析（Duncan分析，P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種著色蘋果冷藏貯藏期間品質(zhì)及pH值變化

表1 蘋果貯藏期間品質(zhì)變化理化指標(biāo)的變化Table1 Changes in physicochemical characteristics of apple during different storage perriiooddss

由表1可知，同一貯藏時(shí)期，顏色好的蘋果的硬度均小于顏色差的蘋果，但可溶性固形物含量卻顯著高于顏色差的蘋果（P＜0.05）。pH值方面，顏色好的蘋果只略大于顏色差的蘋果。對于硬度的變化，無論是顏色好還是顏色差的蘋果，隨著貯藏時(shí)間的延長，硬度均呈現(xiàn)下降趨勢，這與王少敏[17]、李宏建[18]等的研究結(jié)果相一致。2種樣品硬度下降速率在貯藏100～150 d時(shí)達(dá)到最大，貯藏達(dá)第200天時(shí)，果實(shí)的硬度僅為鮮果的66.6%，硬度的減小反映果實(shí)的衰老程度，這說明冷庫貯藏100 d之后，果實(shí)開始迅速衰老，不宜繼續(xù)貯藏，即貯藏100 d之后的蘋果食用價(jià)值顯著降低。顏色好和顏色差的蘋果隨著貯藏時(shí)間的延長，可溶性固形物含量均呈現(xiàn)升高的變化趨勢，不同采收期[19-22]、貯藏條件、果實(shí)品種及果實(shí)自身成熟度等條件均會(huì)影響蘋果的貯藏品質(zhì)。蘋果貯藏期間，果實(shí)衰老，淀粉等糖類物質(zhì)水解導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄從而引起可溶性固形物含量的升高。隨著貯藏時(shí)間的延長，pH值也呈現(xiàn)升高的變化趨勢，升高速率同樣在貯藏100～150 d時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)蘋果中的可滴定酸含量下降時(shí)，果實(shí)的酸度下降，即本實(shí)驗(yàn)得到的貯藏過程中pH值持續(xù)升高的結(jié)果，這一現(xiàn)象與已報(bào)道[17-19]研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

2.2 2種著色蘋果冷藏期間多酚含量變化

2.2.1 總多酚含量的變化

圖1 貯藏期間蘋果總多酚含量的變化Fig.1 Changes in total polyphenols content of apple during different storage periods

2種著色蘋果貯藏期間多酚變化如圖1所示，2種著色蘋果總多酚含量均在貯藏第200天時(shí)降到最低；在貯藏第100天時(shí)達(dá)到最高，顏色好和顏色差的果皮總多酚含量分別為貯藏第200天時(shí)的3.28 倍和3.82 倍，僅稍高于鮮果。在貯藏的各個(gè)時(shí)期，顏色好的蘋果總多酚含量均高于顏色差的蘋果，而兩者總酚的變化趨勢是相同的，均為先降低（蘋果在貯藏期間呼吸作用的自然消耗），再升高（由于蘋果處于低溫環(huán)境而做出的適應(yīng)性變化，以抵抗不良環(huán)境對其呼吸的影響），再下降（蘋果在適應(yīng)環(huán)境之后的自然衰老所致）。

2.2.2 多酚單體含量的變化

表2 貯藏期間蘋果中多酚單體含量變化Table2 Changes in mono-phenol contents during cold storage of apple %

如表2所示，富士蘋果多酚中主要有綠原酸、表兒茶素、金絲桃苷、蘆丁、根皮苷、槲皮苷6 種成分。貯藏過程中，顏色好的蘋果中槲皮苷的變化趨勢為先升高后降低，其余5 種多酚單體變化均為：降低-升高-降低，這與其總酚含量變化相符合；顏色差的蘋果中6 種多酚單體變化均為：降低-升高-降低，也與總酚含量變化相一致。對比顏色好和顏色差蘋果的多酚單體結(jié)果，發(fā)現(xiàn)顏色好的蘋果各單體酚在貯藏第200天時(shí)與鮮果相差不顯著（P＜0.05）；顏色差的蘋果，表兒茶素、異槲皮苷、蘆丁、根皮苷、槲皮素5 種單體酚含量變化都很大，其鮮果中的含量分別為貯藏第200天時(shí)含量的2.54、6.61、2.97、5.10、4.94 倍。另外，表2顯示貯藏第50天時(shí)顏色好的蘋果中金絲桃苷未檢出，這是由于其含量過低，低于了高效液相色譜的檢出下限所致。

對比鮮果和貯藏第200天時(shí)的蘋果發(fā)現(xiàn)，其總多酚和各單體酚含量下降顯著。且在貯藏100 d后，總多酚下降速率顯著增大，即：總多酚在冷庫貯藏前3 個(gè)月內(nèi)保存較好[23]。此外，在貯藏前100 d，蘋果中總多酚含量及各單體酚含量呈先下降后上升趨勢，在第100天時(shí)含量達(dá)到峰值，此時(shí)蘋果的抗性增強(qiáng)，營養(yǎng)價(jià)值最好，是理想的食用時(shí)期。

2.3 PAL活性變化

圖2 貯藏期間蘋果中PAL活性變化Fig.2 Changes in PAL activity during cold storage of apple

如圖2所示，PAL活性在貯藏初期變化較為平緩，在貯藏第100天時(shí)酶活性達(dá)到峰值，而后下降；顏色差的蘋果酶活性變化較顏色好的更為顯著（P＜0.05），且其酶活性始終大于顏色好的蘋果，在峰值處即貯藏第100天時(shí)PAL活性是顏色好蘋果的1.70 倍，是顏色差鮮果的1.75 倍。PAL與多酚的合成有關(guān)，當(dāng)貯藏第100天酶活性達(dá)到最大時(shí)，圖1中總多酚含量在貯藏第100天時(shí)也有一次回升，之后同時(shí)下降，二者的變化趨勢是相符合的。

2.4 PPO、POD活性變化

如圖3所示，顏色差蘋果的PPO活性在貯藏第50天時(shí)達(dá)到峰值，而后下降并在貯藏第100天開始趨于平緩，這與張文英等[24]的研究結(jié)果也是一致的。顏色差蘋果的PPO活性較顏色好的蘋果變化仍舊顯著，且其酶活性始終大于顏色好的蘋果，在峰值處即貯藏第50天時(shí)PPO活性是顏色好蘋果的2.31 倍，是顏色差鮮果的1.99 倍。而顏色好的蘋果酶活性則呈下降趨勢，并在貯藏第50～100天時(shí)達(dá)最大下降速率。由于顏色好蘋果PPO活性小于顏色差蘋果，因而顏色好蘋果的總多酚含量在貯藏期間始終高于顏色差蘋果的總多酚含量，這與圖1中所得的總多酚含量結(jié)果一致。

圖3 貯藏期間蘋果中PPO活性變化Fig.3 Changes in PPO activity during cold storage of apple

圖4 貯藏期間蘋果中POD活性變化Fig.4 Changes in POD activity during cold storage of apple

如圖4所示，POD活性在貯藏初期變化為緩慢下降，在貯藏第150天時(shí)酶活性達(dá)到峰值，而后下降，顏色差的蘋果酶活性變化較顏色好的要?jiǎng)×?，且其酶活性同樣始終大于顏色好的蘋果，在峰值處即貯藏第150天時(shí)POD活性是顏色好蘋果的2.29 倍，是顏色差鮮果的1.79 倍。由于POD和PPO都與多酚的分解有關(guān)，顏色好蘋果POD活性也小于顏色差蘋果，因而顏色好蘋果的總多酚含量在貯藏期間始終高于顏色差蘋果的總多酚含量，這與圖1中所得的總多酚含量結(jié)果是一致的。POD活性在貯藏后期突然增強(qiáng)并出現(xiàn)峰值，這可能是果實(shí)衰老的表現(xiàn)[25-26]。2.5 相關(guān)性分析結(jié)果

表3 相關(guān)性分析Table3 Correlation analysislysis

由表3可以看出，總多酚含量與各多酚單體含量顯著正相關(guān)，即總酚含量高時(shí)，多酚單體含量也高；PAL活性與多酚單體含量顯著正相關(guān)，尤其與綠原酸含量極顯著正相關(guān)，即PAL活性越高，多酚單體含量越高；而PPO和POD活性與多酚單體含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，部分為顯著負(fù)相關(guān)，PPO活性甚至與槲皮苷含量為極顯著負(fù)相關(guān)，即PPO和POD活性越高，多酚單體含量就越低。相關(guān)性分析得到的結(jié)果再一次驗(yàn)證了以上各圖、表呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因而可以認(rèn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性與實(shí)驗(yàn)結(jié)論的可靠性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：晚熟‘富士’蘋果在貯藏期間可溶性固形物含量和pH值持續(xù)上升；貯藏100 d后，硬度開始迅速下降；總多酚含量和各多酚單體含量均在貯藏第100天時(shí)達(dá)到峰值；PAL、PPO、POD的活性變化與總多酚及多酚單體含量變化顯著相關(guān)。

我國的蘋果消費(fèi)一直以鮮食蘋果為主。晚熟‘富士’蘋果10月中旬入冷庫貯藏，從11月開始冷庫貯藏的大量‘富士’蘋果開始供應(yīng)市場，持續(xù)至第2年1月底、2月初，此時(shí)蘋果貯藏了100 d左右，時(shí)間約為春節(jié)前后，正值蘋果消費(fèi)高峰期。通過進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人的研究成果進(jìn)行對比總結(jié)，得到蘋果僅適宜于這一時(shí)間段的冷庫貯藏，超過這個(gè)時(shí)間段，蘋果會(huì)迅速衰老，各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)和多酚含量均開始顯著下降，蘋果最終變得不適合食用。而在貯藏第100天左右時(shí)的蘋果從營養(yǎng)價(jià)值上來說是最具有食用價(jià)值的。此時(shí)正值國內(nèi)蘋果消費(fèi)的高峰期，這既迎合了消費(fèi)需求，又使蘋果的營養(yǎng)最大化被消費(fèi)者利用。

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Relationship of Coloration with Polyphenols and Related Enzyme Activities during Low-Temperature Storage of Apple

BAI Ge GUO Yurong*′CHEN Lei ZHANG Xiaorui
(College of Food Engineering and Nutritional Science Shaanxi Normal University Xi’an 710119′China)

The color of apple has a direct impact on its quality and storability We used apples with a percentage of red color area no less than 80% or no more than 20% to analyze their quality parameters polyphenols and related enzyme activities during low-temperature storage The quantitative analysis of polyphenols was performed by HPLC The physicochemical analyses showed that a constant decrease in fruit firmness was observed whereas soluble solids content and pH increased continuously during storage The changes in total polyphenol and mono-phenol contents consistently followed a decreaseincrease-decrease trend and reached peaks after 100 days of storage Concurrently the activity of phenylalnine ammonialyase (PAL attained a peak However the activities of polyphenol oxidase (PPO and peroxidase (POD reached their peaks after 50 and 150 days of storage respectively All of the three enzyme activities were closely related with polyphenols content in apple All of the above results demonstrate that apple has the maximum nutritional value when the storage period is 100 days.

apple low-temperature storage physicochemical indicators enzyme activity polyphenols

S661.1

A

1002-6630（2015）06-0246-05

10.7506/spkx1002-6630-201506047

2014-07-19

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-28）

白鴿（1992—），女，碩士研究生，主要從事食品功能成分開發(fā)利用研究。E-mail：baige132196@163.com

*通信作者：郭玉蓉（1962—），女，教授，博士，主要從事食品生物加工研究。E-mail：guoyurong730@163.com