周琰冰，艾啟俊′*，張德權(quán)*

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

4 ℃貯藏期內(nèi)冷鮮羊肉表面菌相變化分析

周琰冰1，艾啟俊1′*，張德權(quán)2′*

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

研究4℃條件下貯藏時(shí)間對冷鮮羊肉表面菌相組成的影響，以菌落總數(shù)為指標(biāo)，結(jié)合菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法，了解冷鮮羊肉在其貯藏期內(nèi)的菌群構(gòu)成，以及隨著貯藏時(shí)間延長其優(yōu)勢菌群的變化。結(jié)果表明，冷鮮羊肉在4℃托盤貯藏條件下，菌落總數(shù)隨貯藏時(shí)間的延長而增加，第7天其菌落總數(shù)超過106CFU/g，樣品已經(jīng)腐敗變質(zhì)；其表面主要菌群包括假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬等。隨著貯藏時(shí)間的變化，假單胞菌占總菌相的大部分，是造成冷鮮羊肉腐敗變質(zhì)的主要優(yōu)勢菌。

冷鮮羊肉；菌落總數(shù)；菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；4 ℃冷藏；優(yōu)勢菌

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，我國肉品生產(chǎn)得到了快速提高，據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局公布數(shù)據(jù)顯示，2013年我國肉類總產(chǎn)量8 535萬 t，比上年增長1.7%[1]。但是，畜體屠宰及加工過程中損失率高、品質(zhì)較低、貨架期較短等問題一直阻礙著我國肉類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

冷鮮肉是指將屠宰后的畜胴體進(jìn)行冷卻處理后，其胴體溫度在24 h之內(nèi)降至0～4 ℃，并在后續(xù)加工、運(yùn)輸和銷售過程中一直保持此溫度的生鮮肉[2]。低溫能夠抑制大多數(shù)酶的活性和微生物的生長繁殖?；诶漉r肉的各種優(yōu)勢，國家明確指出，要在2015年使冷鮮肉占比提高到30%，可見冷鮮肉將是我國肉類行業(yè)發(fā)展的必然趨勢[3]。畜肉由于受到微生物和酶作用以及環(huán)境中溫度、氧氣、水分等條件的影響，很容易腐敗變質(zhì)。肉品在一定條件下貯藏時(shí)，細(xì)菌的數(shù)目幾乎呈線性增加[4]。所以，細(xì)菌數(shù)目的變化可以作為判斷肉品被污染程度以及肉品衛(wèi)生質(zhì)量的評判標(biāo)準(zhǔn)之一。因此，冷鮮肉的保鮮要考慮到抑制表面微生物的生長繁殖以及氧化作用造成的肉品質(zhì)降低。

羊肉在我國相當(dāng)受歡迎，2013年我國羊肉產(chǎn)量達(dá)到408萬 t，增長2.0%[1]，不僅肉品鮮嫩，營養(yǎng)充足，易于消化，而且進(jìn)食時(shí)不用考慮文化與宗教的禁忌[5]。但是，肉中的微生物來源廣泛，品種眾多，包含真菌、細(xì)菌、病毒等，可分為食物中毒性微生物、致病性微生物以及致腐性微生物三大類群及其他微生物[6]。傳統(tǒng)的微生物檢測大多以分離純化培養(yǎng)為基礎(chǔ)，再根據(jù)菌落形態(tài)及生理生化特征確定其類型，但此方法耗時(shí)較長，需要1～2 d的培養(yǎng)時(shí)間，并對單菌落進(jìn)行各種生理指標(biāo)測定來確定其種屬，因此，這種傳統(tǒng)的研究方法只能作為一種輔助手段，需要與其他方法結(jié)合起來才能客觀而全面反映微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)信息。

在食品工業(yè)中，生物技術(shù)是一種得以讓人類生活質(zhì)量發(fā)生進(jìn)步的科學(xué)措施，通過利用生物流程生產(chǎn)細(xì)胞或其代謝物質(zhì)來生產(chǎn)食物并改變以前的生產(chǎn)過程[7]。菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種直接從培養(yǎng)基中獲得單個(gè)菌落，或者直接分析需要的DNA片段部分的方法[8]，它被應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、真菌的研究中[9-11]。與普通DNA的PCR不同在于菌落PCR的方法不提取基因組DNA，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，省時(shí)少力，可以快速鑒定菌落是否為含目的質(zhì)粒的陽性菌落。操作簡單、快捷，陽性率較高，結(jié)果具有高度的特異性和敏感性，在轉(zhuǎn)化鑒定中較常見[12]，還經(jīng)常用于基因擴(kuò)增，分類篩選和診斷等實(shí)驗(yàn)中[13]。

已有研究[14-16]利用選擇培養(yǎng)基的方法分離和鑒定冷鮮羊肉的菌相消長規(guī)律，但培養(yǎng)時(shí)間長，培養(yǎng)條件要求多，不能快速知曉冷鮮肉表面的菌相情況。而本研究則是以菌落總數(shù)為指標(biāo)，判斷托盤包裝冷鮮羊肉在4 ℃條件下的貯藏期，并通過菌落PCR方法對冷鮮羊肉貯藏過程中表面微生物的多樣性進(jìn)行研究，從而了解冷鮮羊肉在其貯藏期內(nèi)的菌群構(gòu)成，以及隨著貯藏時(shí)間延長其優(yōu)勢菌群的菌相變化。與前人的方法相比較，菌落PCR節(jié)省了鑒定各種微生物生理生化指標(biāo)的時(shí)間，通過返回的序列進(jìn)行同源性比對，可以得知樣品表面的菌相構(gòu)成并判斷其消長規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊前腿肉（當(dāng)天屠宰）購自北京農(nóng)學(xué)院便民超市，返回實(shí)驗(yàn)室后將其迅速放入—20 ℃冰箱內(nèi)1h，使其中心溫度降至4 ℃后，取出置于4 ℃冰箱保藏。

營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、NaCl（分析純）、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、冰醋酸 北京藍(lán)弋試劑有限公司；Primer Eu27F、1492R 生工生物工程（上海）股份有限公司；TaKaRa TaqTMPremix、DL2000、Andy Safe核酸染料 北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YT-CJ-1ND型超凈工作臺 北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開發(fā)中心；TCYQ型全溫振蕩器 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；MLS-3780型全自動高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；MyCycler Thermal Cycler型PCR儀、76S106783型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；TE212-L型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；BG-subMINI型迷你水平電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；BCD-288WSL型冰箱 青島海爾股份有限公司；DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；微波爐 廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司。

1.3 方法

利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法和菌落PCR技術(shù)進(jìn)行冷鮮羊肉表面微生物種類的分析。

1.3.1 樣品準(zhǔn)備

取出中心溫度已降至4 ℃的羊大腿肉，放置在無菌超凈臺內(nèi)，用無菌刀除去其表面筋膜與脂肪，切成約10 g的肉塊，隨機(jī)挑選3 塊為一組樣品，放入無菌托盤內(nèi)，用無菌保鮮膜包好后，置于4 ℃冰箱內(nèi)備用。準(zhǔn)備6 組樣品，每天測定冷鮮羊肉表面的菌落總數(shù)，直至其菌落總數(shù)超過國家規(guī)定數(shù)值。

1.3.2 菌落總數(shù)測定

按照GB 4789.2—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測定》[17]進(jìn)行測定。

取一份樣品置于無菌操作臺內(nèi)，用無菌剪刀剪碎后置于帶濾網(wǎng)的無菌均質(zhì)袋內(nèi)，倒入90 mL 0.85%已滅菌的生理鹽水，均質(zhì)機(jī)拍打1 min，制成1∶10的稀釋液，靜置5 min后，吸取上清液1 mL于裝有9 mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，制成1∶100的樣品勻液，制備10 倍系列稀釋樣品勻液。

平皿中倒入15 mL左右冷卻至50 ℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，稍轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿后平放在超凈操作臺，待瓊脂凝固后，根據(jù)對樣品污染情況的估計(jì)，選擇2～3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，吸取100 μL稀釋液于培養(yǎng)基表面，用涂布棒涂勻，平板靜置10 min后于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48 h，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落總數(shù)，選擇菌落數(shù)在30～300 CFU范圍內(nèi)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)后放于4 ℃冰箱內(nèi)貯藏備用，平行實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.3 菌懸液制備

選取菌落總數(shù)在30～300 CFU范圍內(nèi)的平皿，菌落計(jì)數(shù)，用記號筆標(biāo)記出每個(gè)可見單菌落的位置，劃分區(qū)域，用接種環(huán)依次挑取每個(gè)單菌落于裝有5 mL滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管內(nèi)，盡量保證所有數(shù)據(jù)采集完整，搖床37 ℃、160 r/min振蕩過夜。待菌懸液制備后，用移液槍從每支試管內(nèi)吸取100 μL菌液，垂直滴落在已凝固的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，靜置10min左右，倒扣于（36±1） ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行保種，待單菌落生成后，將平板置于4 ℃冰箱內(nèi)保藏備用，菌懸液置于冰箱內(nèi)備用。

1.3.4 PCR擴(kuò)增

采用細(xì)菌16S rDNA通用引物（Eu27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和（1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，以上一步中已振蕩過夜培養(yǎng)并經(jīng)過保種實(shí)驗(yàn)后能夠成功得到單菌落的菌懸液作為模板，添加1 μL于反應(yīng)體系中，補(bǔ)充ddH2O 22 μL至反應(yīng)總體系為50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段長度為1 500 bp左右，PCR反應(yīng)原液置于4 ℃貯藏備用。

1.3.5 序列測序

PCR原液的測序工作由上海生工生物有限公司完成，測序后的拼接結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST（http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）相似序列檢索比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏時(shí)間條件下菌落總數(shù)變化

表1 不同貯藏時(shí)間對冷鮮羊肉表面菌落總數(shù)的影響Table1 Effects of storage time on the total number of colonies on chilled fresh muttttoonn

我國對于冷鮮肉的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)尚無菌落總數(shù)指標(biāo)，一般菌落總數(shù)參考評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為新鮮肉相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[18-19]。本實(shí)驗(yàn)測定了不同貯藏時(shí)間后冷鮮羊肉表面的菌落總數(shù)，從表1可以看出，隨著貯藏時(shí)間延長，冷鮮羊肉表面的菌落總數(shù)呈上升趨勢，貯藏一段時(shí)間后樣品表面的菌落總數(shù)由最初的103CFU/g增加到了106CFU/g，根據(jù)參考標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，冷鮮肉細(xì)菌菌落總數(shù)不能超過1×106CFU/g，因此，冷鮮羊肉在4 ℃條件下貯藏時(shí)間一般不超過7 d。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified products

以菌懸液作為DNA模板，利用細(xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得長度約1 500 bp的片段，結(jié)果見圖1。所有樣品均可見較明亮的擴(kuò)增條帶，且陰性對照孔無條帶出現(xiàn)，說明操作過程方法可行，操作規(guī)范無污染，本實(shí)驗(yàn)的PCR擴(kuò)增條件是合適的。

2.3 貯藏期內(nèi)冷鮮羊肉表面優(yōu)勢菌組成分析及其變化規(guī)律

表2 不同貯藏時(shí)間條件下冷鮮羊肉單菌落個(gè)數(shù)Table2 Individual colony numbers of chilled fresh mutton as a function of storage ttiimmee

由表2可知，以每個(gè)單菌落制備菌懸液作為DNA模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有部分損失，但整體送檢有效率能夠達(dá)到87%以上，實(shí)驗(yàn)方法操作可行。

表3 貯藏期內(nèi)冷鮮羊肉表面優(yōu)勢菌組成比例Table3 The composition of dominant bacteria on chilled fresh mutton as a function of storage ttiimmee%

分析貯藏期冷鮮羊肉各種細(xì)菌占總菌數(shù)的百分比，通過表3分析測序結(jié)果可以看出，冷鮮羊肉貯藏初期，微生物種類較多，其中，假單胞菌、芽孢桿菌和不動桿菌所占比例較大，隨著貯藏時(shí)間的延長，冷鮮羊肉表面的優(yōu)勢菌有了明顯的變化，到了貯藏第3天，假單胞菌所占比例較前2 d有了大幅增加，而初始比例較大的芽孢桿菌和不動桿菌的占比卻有所下降；當(dāng)達(dá)到貯藏第7天時(shí)，送檢樣品只檢測出兩種細(xì)菌，而假單胞菌更是占送檢樣品結(jié)果的98%，所占比例占明顯優(yōu)勢，成為冷鮮羊肉表面的絕對優(yōu)勢菌群。

由此可以看出，冷鮮羊肉表面初始微生物包括假單胞菌、不動桿菌、芽孢桿菌以及檢測到的球菌、桿菌等微生物，而在貯藏后期，優(yōu)勢菌群主要為假單胞菌，隨著貯藏時(shí)間的延長，嗜冷桿菌的數(shù)量也呈小幅增加趨勢，氣單胞菌在貯藏后期也可檢出，但最主要的菌群是假單胞菌，是造成托盤包裝的冷鮮羊肉腐敗的主要微生物。

3 結(jié)論與討論

以單菌落的菌懸液作為DNA模板，利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后可以獲得約1 500 bp的片段長度，操作過程方法可行，相比于傳統(tǒng)的微生物分離鑒定方法判斷樣品菌落的變化規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚬?jié)省鑒定單菌落各生理生化指標(biāo)的時(shí)間，一定程度上減少實(shí)驗(yàn)員的工作量。

托盤包裝冷鮮羊肉中的初始微生物主要包括了假單胞菌、芽孢桿菌、不動桿菌、嗜冷桿菌、氣單胞菌屬等微生物，其中，假單胞菌、芽孢桿菌和不動桿菌屬在冷鮮羊肉貯藏初期占據(jù)優(yōu)勢地位，隨著時(shí)間的延長，假單胞菌的增長速率加快，貯藏后期，它在數(shù)量上占有絕對優(yōu)勢，是引起冷鮮羊肉腐敗的主要微生物，這與已有研究[20]指出的常存在于胴體和分割肉表面的微生物主要為假單胞菌、不動桿菌、氣單胞菌屬等嗜冷菌的結(jié)論一致。

采用菌落計(jì)數(shù)法測定冷鮮羊肉表面菌落總數(shù)，參考GB 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[19]：新鮮肉為104CFU/g以下、次鮮肉為104～106CFU/g、變質(zhì)肉為106CFU/g以上。樣品冷鮮羊肉在第7天的菌落總數(shù)超過106CFU/g，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)已腐敗變質(zhì)，不可再食用。在4℃條件下，冷鮮羊肉貯藏時(shí)間不超過7 d。

本實(shí)驗(yàn)通過菌落計(jì)數(shù)與菌落PCR法，可以有效判斷貯藏期間冷鮮羊肉表面菌相的變化。樣品在低溫貯藏初期保持了一定的新鮮度，說明低溫環(huán)境和保鮮膜包裝可在一定程度上抑制微生物的生長繁殖，從而延緩羊肉腐敗變質(zhì)速率，在第0天時(shí)樣品表面細(xì)菌種類多，所占比例相對平均，而到第7天時(shí)，細(xì)菌種類只剩下2 種，并且假單胞菌所占比例極大。這表明在對羊肉進(jìn)行保鮮的過程中，不僅要利用合理的保鮮方法，還要找到抑制假單胞菌的有效方法。

大部分微生物，如致病菌和嗜溫菌，在冷藏條件下其生長因溫度因素影響而受到抑制，但4 ℃冷藏條件不能完全抑制嗜冷菌的生長繁殖。假單胞菌是一類革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界中，在冷藏溫度條件下可以快速生長，大部分報(bào)道指出，假單胞菌在低溫有氧貯藏條件下具有很高的生長率，決定了冷鮮肉的貨架期[21-24]，當(dāng)溫度是唯一或者主要的限制因素時(shí)，假單胞菌在冷藏食品中的生長速率比其他污染細(xì)菌的生長速率快30%[25]。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論，所以在使用各種保鮮技術(shù)對羊肉進(jìn)行保鮮時(shí)，還應(yīng)該特別找出抑制假單胞菌的方法，這樣才能更好的保持冷鮮羊肉的品質(zhì)，以延長保質(zhì)期。

為此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)加強(qiáng)對假單胞菌一些特性反應(yīng)的研究，尋求一種定性定量的快速方法，能夠判斷冷鮮肉表面假單胞菌的含量，從而快速判斷肉品的新鮮度。此外實(shí)驗(yàn)送樣測序的返回率未達(dá)到100%，證明實(shí)驗(yàn)中存在著數(shù)據(jù)的損失，這和人為實(shí)驗(yàn)操作有密不可分的關(guān)系，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要加強(qiáng)對這方面干擾的控制。

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Changes in Microflora on Fresh Mutton during Chilled Storage

ZHOU Yanbing1′AI Qijun1′*′ZHANG Dequan2′*

(1. College of Food Science and Engineering Beijing University of Agriculture Beijing 102206′China; 2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology Chinese Academy of Agricultural Sciences Beijing 100193′China)

The composition of the bacterial microflora on fresh mutton as a function of storage time at 4 ℃ was determined by total plate count and colony polymerase chain reaction (PCR). The results showed that the total number of colonies on tray-packaged mutton increased with an increase in storage time and exceeded 106CFU/g at the seventh day indicating spoilage of the mutton The main bacteria were Pseudomonas′ Bacillus Acinetobacter and etc During storage Pseudomonas became the dominant spoilage bacterium in chilled meat.

chilled fresh mutton total number of colonies colony PCR refrigeration at 4 ℃; dominant bacteria

TS201.3

A

1002-6630（2015）06-0242-04

10.7506/spkx1002-6630-201506046

2014-06-24

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303083）

周琰冰（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全控制。E-mail：starella@aliyun.com

*通信作者：艾啟?。?954—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩?、農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制。E-mail：aiqj@sohu.com張德權(quán)（1972—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槿馄芳庸づc安全。E-mail：dqzhang0118@126.com