何曉妹　福建省龍巖市武平縣中赤鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站364312

纖維素酶對(duì)甘蔗梢酶解效果研究

何曉妹福建省龍巖市武平縣中赤鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站364312

以甘蔗梢為材料，設(shè)置1.00 IU/g、2.00 IU/g、3.00 IU/g、4.00 IU/g、5.00 IU/g和6.00 IU/g六個(gè)不同的纖維素酶添加量，研究纖維素酶對(duì)甘蔗梢的酶解效果。結(jié)果表明：（1）在0～6.00 IU/g范圍內(nèi)，纖維素酶水解甘蔗梢能極顯著提高還原糖生成量，而且還原糖生成量隨纖維素酶添加量的增加而顯著提高（P＜0.01）。（2）在0～3.00 IU/g范圍內(nèi)，纖維素酶水解甘蔗梢能極顯著降低中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量（P＜0.01），而在3.00～6.00 IU/g時(shí)，NDF和ADF的含量隨纖維素酶添加量的增加而有逐步降低的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05），表明纖維素酶最佳添加量為3.00 IU/g，此時(shí)NDF和ADF含量分別為61.80%、34.69%，與對(duì)照組相比分別降低了16.04%（P＜0.01）和9.68%（P＜0.01）。（3）纖維素酶不同添加量對(duì)甘蔗梢酸性不溶性灰分（AIA）、酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）、灰分（Ash）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）含量的影響均不顯著（P＞0.05）。

纖維素酶甘蔗梢酶解還原糖

近年來，隨著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展，飼料資源日趨緊張，因此開發(fā)利用玉米和谷物秸稈、甘蔗梢、甘蔗渣等農(nóng)副產(chǎn)品飼料發(fā)展食草型、節(jié)糧型畜牧業(yè)不僅可節(jié)約飼料資源，而且可促進(jìn)農(nóng)業(yè)的良性循環(huán)。由于這些農(nóng)副產(chǎn)品纖維含量高，消化率較低，適口性差，限制了其在畜牧生產(chǎn)中的利用，僅有少量的作為非常規(guī)能量飼料被利用，大多數(shù)是被丟棄或直接燒掉，不僅造成巨大的資源浪費(fèi)，而且污染環(huán)境，帶來公害。因此，充分利用我們有限的飼料資源，挖掘出現(xiàn)有飼料資源的潛力，因地制宜地開發(fā)利用非常規(guī)飼料成為解決問題的一個(gè)主要途徑，同時(shí)也是當(dāng)今世界飼料發(fā)展趨勢(shì)之一[1]。

甘蔗是輕工業(yè)的重要原料，同時(shí)甘蔗生產(chǎn)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占重要的地位，我國(guó)是世界上主要的蔗糖生產(chǎn)國(guó)之一[2]。甘蔗梢是收獲甘蔗時(shí)砍下的頂上2～3個(gè)嫩節(jié)和青綠色葉片的統(tǒng)稱，俗稱“甘蔗尾”，是制糖業(yè)的副產(chǎn)品。目前生產(chǎn)中只能直接利用小部分，大部分用于自然肥田或曬干作燃料，利用率很低，如果這些甘蔗梢能被充分利用起來作為飼料，對(duì)當(dāng)?shù)氐男竽琉B(yǎng)殖業(yè)具有重要意義。

纖維素是地球上最豐富的可再生資源，是植物細(xì)胞壁的主要成分，占植物干重的35%～50%，由β-1,4葡萄糖苷鏈連接葡萄糖苷形成的線形聚合體，不溶于水，可被纖維素酶水解成葡萄糖[3]。但目前各種農(nóng)作物副產(chǎn)品，如秸桿、秕殼、甘蔗梢等因含有大量動(dòng)物難以吸收利用的纖維素而大都作為農(nóng)田肥料和燃料，大部分沒有被利用，而是通過微生物自然分解，參與自然界碳素循環(huán)，造成極大地浪費(fèi)。如果能有效地利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)將這些纖維素轉(zhuǎn)化成簡(jiǎn)單糖，不僅可以變廢為寶，而且還可以避免環(huán)境污染，纖維素酶的研究為此開辟了一條廣闊的途徑[4]。

纖維素酶是降解纖維素原料生成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單種酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系。一個(gè)完整的纖維素酶系至少包括3類性質(zhì)不同的酶：內(nèi)切葡聚（endo-1,4-β-D-glucanase，EG），外切葡聚糖酶（exo-1,4-β-D-glucannase，CBH），和β-葡聚糖苷酶（β-1,4-glucosidase，BG）[5]。3種酶協(xié)同作用，完成對(duì)纖維素的降解，纖維素酶使纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖的機(jī)理和詳細(xì)過程至今仍不十分清楚，被普遍接受的理論主要有3種：協(xié)同理論（Synergism）、原初反應(yīng)假說（Initial degrading）和碎片理論（Fragmentation），而以協(xié)同理論最為廣泛接受[6]。不同來源的纖維素酶其組成及各組分比例有較大差異，同時(shí)纖維素酶作用的底物也比較復(fù)雜，致使纖維素酶活力的測(cè)定方法很多，且方法復(fù)雜而不統(tǒng)一[7]。常用的方法有：CMC糖化力法[8]、CMC液化力法、濾紙?zhí)腔Ψ╗9]、濾紙崩潰法和棉花糖化力法等[10]。

在甘蔗梢含有的各營(yíng)養(yǎng)成分中，纖維類物質(zhì)對(duì)其消化率的影響最大、最直接，根據(jù)瘤胃微生物對(duì)其利用狀況，可將植物細(xì)胞分為細(xì)胞內(nèi)容物和細(xì)胞壁兩部分。細(xì)胞內(nèi)容物的降解率可達(dá)90%以上，植物細(xì)胞壁的主要組成部分為中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF），很難被微生物利用[11]。纖維素酶能降解植物細(xì)胞壁，使胞內(nèi)原生質(zhì)暴露出來，提高胞內(nèi)物質(zhì)的消化率。Qureshi等[12]在大麥基礎(chǔ)日糧中添加0.08%纖維素酶，顯著提高了肉雞日增重，對(duì)提高其飼用價(jià)值、消除抗?fàn)I養(yǎng)因子具有重要意義。對(duì)我省乃至我國(guó)南方地區(qū)甘蔗梢的利用，促進(jìn)飼料資源的開發(fā)與利用具有指導(dǎo)意義和參考價(jià)值。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1甘蔗梢甘蔗收獲季節(jié)取新鮮無病蟲害甘蔗梢，65℃下烘干，粉碎，過40目篩后置于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2纖維酶制劑纖維素酶購(gòu)自上?？笊锛夹g(shù)有限公司。

1.1.3試劑硫酸、硫酸銅、十二烷基硫酸鈉、硫酸鉀為化學(xué)純；氫氧化鈉、硼酸、葡萄糖、無水乙醚、丙酮、十氫萘、無水亞硫酸鈉、十六烷三甲基溴化銨、檸檬酸鈉、檸檬酸、十氫萘、無水亞硫酸鈉和二胺四乙酸二鈉四硼酸納為分析純。

1.1.4試驗(yàn)儀器水浴恒溫振蕩器SHA-C；UV-2000分光光度計(jì)；AG-204梅特勒-托利多分析天平；PHS-3D型pH計(jì)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱；GL-20G-Ⅱ冷凍離心機(jī)；JK-1型遠(yuǎn)紅外消煮器；半定量蒸餾裝置；CXC-06粗纖維測(cè)定儀；SZF-06A粗脂肪測(cè)定儀；2ZX直聯(lián)旋片式真空泵；各種規(guī)格（0.1～ 1 000μL）單道可調(diào)移液器；微型植物試樣粉碎機(jī)FZ102（微型高速萬能試樣粉碎機(jī)）。

1.1.5溶液

1）1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：將葡萄糖在恒溫干燥箱中105℃下干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取100 mg于100 mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，搖勻。4℃冰箱中保存。

2）3,5-二硝基水楊酸（DNS）溶液：準(zhǔn)確稱取3,5-二硝基水楊酸6.3 g，用少量蒸餾水溶解，然后加入2 mol/L NaOH溶液262 mL，加到500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉的熱溶液中，再加5 g苯酚和5 g無水亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后定容至1 000 mL。貯于棕色瓶中，室溫放置1周后使用。

3）0.05 mol/L、pH4.8檸檬酸緩沖液：取0.1 mol/L檸檬酸溶液205 mL，0.1 mol/L檸檬酸鈉溶液295 mL，充分混勻，定容至1 000 mL。4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4）中性洗滌劑（30 g/L十二烷基硫酸鈉）：準(zhǔn)確稱取乙二胺四乙酸二鈉18.6 g和6.8 g硼酸鈉一同放入1 000 mL燒杯中，加入少量蒸餾水，加熱溶解，再加入30 g十二烷基硫酸鈉和10 mL乙二醇乙醚。稱取4.65 g無水磷酸氫二鈉置于另一燒杯中，加入少量水，微加熱溶解后倒入第一個(gè)燒杯中，加入蒸餾水定容到1 000 mL，搖勻，備用。

5）酸性洗滌劑（20 g/L十六烷三甲基溴化銨）：稱取20 g十六烷三甲基溴化銨，溶于1 000 mL濃度為0.5 mol/L硫酸溶液中，攪拌溶解。

6）72%硫酸溶液：734.69 mL濃硫酸，加入200 mL水中，冷卻后稀釋至1 000 mL。

7）0.05 moLHCl溶液：量取4.2 mL比重1.19 g加1的濃鹽酸167 mL，置于1 000 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋，定容到刻度。

8）2%硼酸溶液：20 g硼酸溶于1 000 mL蒸餾水中。

9）40%氫氧化鈉溶液：40 g氫氧化鈉溶于100 mL蒸餾水中。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，纖維素酶添加量設(shè)6梯度，分別為1.00 IU/g、2.00 IU/g、3.00 IU/g、4.00 IU/g、5.00 IU/g和6.00 IU/g，以不添加纖維素酶的甘蔗梢粉做空白組對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1纖維素酶活性（濾紙酶活）測(cè)定纖維素酶活性（濾紙酶活）測(cè)定：3,5-二硝基水楊酸法（DNS法）。實(shí)驗(yàn)做3組重復(fù)，在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)的葡萄糖含量，按公式計(jì)算出濾紙酶活力（IU/g）。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，取平均值。

濾紙酶活（IU）=

酶活單位定義：以濾紙作底物，在pH4.8、50℃下，每分鐘生成1μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（IU）。

1.3.2甘蔗梢粉水解甘蔗梢粉121℃滅菌30 min，準(zhǔn)確稱取3 g，加入90 mL pH4.8檸檬酸緩沖液，然后按試驗(yàn)設(shè)計(jì)量添加樣品酶，在50℃水浴振蕩器內(nèi)震蕩酶解反應(yīng)8 h。酶水解產(chǎn)物經(jīng)6 000 r/ min離心，分離得酶水解糖液進(jìn)行還原糖含量分析，固體部分105℃烘干，分析常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分。

1.3.3還原糖的測(cè)定方法DNS法測(cè)定還原糖量，以對(duì)照組調(diào)零，測(cè)定酶解液540 nm的吸光度值，在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對(duì)應(yīng)的葡萄糖含量，以葡萄糖量作為總還原糖量。

1.3.4常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定CP：凱氏定氮法；Ash：高溫灼燒；NDF：Van Soest法；ADF：Van Soest法；EE：殘余法；ALD：Van Soest法；AIA：Van Soest法。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA單因子方差分析，以0.05（差異顯著）、0.01（差異極顯著）作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖含量及其對(duì)應(yīng)的540 nm的吸光度值，見表1。根據(jù)數(shù)據(jù)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y= 0.9271X-5.32×10-2，相關(guān)系數(shù)為0.9965。

表1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

2.2纖維素酶濾紙酶活力濾紙酶活力的測(cè)定數(shù)據(jù)為0.00 IU、97.72 IU、98.32 IU、100.11 IU，取平均值，得出纖維素酶的活性是98.72 IU。

2.3纖維素酶水解甘蔗梢還原糖生成量酶解后各組還原糖生成量,分別為3.66±0.02 mg/mL、6.15± 0.03 mg/mL、8.44±0.04 mg/mL、8.83±0.03 mg/mL、8.99±0.03 mg/mL、9.19±0.07 mg/mL。

隨著纖維素酶添加量增多，還原糖生成量也逐漸增多，且各處理組間還原糖生成量存在極顯著差異（P＜0.01）。當(dāng)纖維素酶添加量小于3.00 IU/g時(shí)，隨著纖維素酶添加量的增加，還原糖的生成量迅速增加；當(dāng)纖維素酶添加量大于3.00 IU/g時(shí)，隨著纖維素酶添加量的增加，還原糖生成量仍然顯著提高。

2.4纖維素酶不同添加量對(duì)甘蔗梢NDF含量的影響酶解后各處理組NDF的含量分別為73.61± 0.14%、68.42±0.32%、65.02±1.03%、61.80±0.50%、61.45±0.25%、61.10±0.53%、60.76±0.26%。各處理組的NDF含量與對(duì)照組相比均有降低，且差異極顯著（P＜0.01），各處理組NDF含量與對(duì)照組相比分別降低了7.05%（P＜0.01）、11.67%（P＜0.01）、16.04%（P＜0.01）、16.52%（P＜0.01）、16.99%（P＜0.01）、17.46%（P＜0.01）。

隨著纖維素酶量的增加，甘蔗梢中NDF含量隨著降低，當(dāng)纖維素酶添加量小于3.00 IU/g時(shí)，隨著酶量增加，NDF含量迅速降低，當(dāng)加酶量大于3.00 IU/g時(shí)，隨著酶量增加，NDF含量有所降低但是變化不明顯。表明纖維素酶最佳添加量為3.00 IU/g，此時(shí)NDF含量為61.80%。各處理組NDF含量比較分別為：第Ⅰ組和第Ⅱ組與其他各處理組差異極顯著（P＜0.01），第Ⅲ組與第Ⅵ組間差異顯著，其他各處理組間均差異不顯著（P＞0.05）。

2.5纖維素酶不同添加量對(duì)甘蔗梢ADF含量的影響各處理組ADF的含量分別為38.41±0.12%、37.78±0.22%、36.20±0.16%、34.69±0.12%、34.72± 0.17%、34.55±0.31%、34.46±0.21%，且與對(duì)照組相比分別降低了1.64%（P＜0.01）、5.75%（P＜0.01）、9.68%（P＜0.01）、9.61%（P＜0.01）、10.05%（P＜0.01）、10.28%（P＜0.01）。

各組的ADF含量與對(duì)照組相比均有降低，且差異均極顯著（P＜0.01）。而隨著纖維素酶量的增加，甘蔗梢中ADF含量會(huì)隨著降低，當(dāng)纖維素酶添加量小于3.00 IU/g時(shí)，隨著酶量增加，ADF含量迅速降低，當(dāng)加酶量大于3.00 IU/g時(shí)，隨著酶量增加，NDF含量有所降低但是變化不明顯。各處理組ADF含量比較分別為：第Ⅰ組和第Ⅱ組與其他各處理組差異極顯著（P＜0.01），其他各處理組間均差異不顯著（P＞0.05）。

2.6纖維素酶不同添加量對(duì)甘蔗梢其他營(yíng)養(yǎng)成分的影響酶解后各組AIA、ADL、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪的含量見表2。

甘蔗梢酶解后各組其他營(yíng)養(yǎng)成分的含量見表2。各組的AIA含量與對(duì)照組相比有降低的趨勢(shì)，但第Ⅱ組有較小的升高，且差異不顯著（P＞0.05），各處理組AIA含量與對(duì)照組分別為0.58%（P＞0.05）、0.58%（P＞0.05）、2.91%（P＞0.05）、5.23%（P＞0.05）、2.91%（P＞0.05）、4.07%（P＞0.05）。而隨著纖維素酶量的增加，各組間甘蔗梢中AIA含量隨著不斷變化，且各處理組間差異不顯著（P＞0.05）。

表2　各組AIA、ADL、Ash、CP、EE含量

各組的ADL含量與對(duì)照組相比均有降低，但差異不顯著（P＞0.05）。各處理組ADL含量與對(duì)照組相比分別降低了3.23%（P＞0.05）、2.30%（P＞0.05）、3.92%（P＞0.05）、4.61%（P＞0.05）、4.15%（P＞0.05）、4.84%（P＞0.05）。而隨著纖維素酶量的增加，甘蔗梢中ADL含量隨之發(fā)生變化，各處理組間差異不顯著（P＞0.05）。

各組的粗灰分含量與對(duì)照組相比均有降低，但差異不顯著（P＞0.05）。各處理組Ash含量與對(duì)照組分別降低了1.01%（P＞0.05）、1.22%（P＞0.05）、1.22%（P＞0.05）、1.43%（P＞0.05）、1.63%（P＞0.05）、1.83%（P＞0.05）。而隨著纖維素酶量的增加，甘蔗梢中粗灰分含量有降低的趨勢(shì)，但第Ⅱ組和第Ⅲ組間并沒有變化，且各組間差異不顯著（P＞0.05）。

各組的粗蛋白含量與對(duì)照組相比均有增加的趨勢(shì)，分別為了0.16%（P＞0.05）、0.16%（P＞0.05）、0.16%（P＞0.05）、0.31%（P＞0.05）、0.31%（P＞0.05）、0.31%（P＞0.05）。而隨著纖維素酶量的增加，甘蔗梢粗蛋白含量也發(fā)生變化,但第Ⅰ組、第Ⅱ組和第Ⅲ組含量相同，第Ⅳ組、第Ⅴ組和第Ⅵ組含量相同；各處理組間差異不顯著（P＞0.05）。

各組的粗脂肪含量與對(duì)照組相比均有增加，分別增加了0.44%（P＞0.05）、0.44%（P＞0.05）、0.87%（P＞0.05）、0.44%（P＞0.05），第Ⅴ組與對(duì)照組粗脂肪的含量幾乎沒有增加（P＞0.05）、0.87%（P＞0.05）。而隨著纖維素酶量的增加，甘蔗梢粗脂肪含量也隨著變化，各處理組間差異不顯著（P＞0.05）。

3　討論

許維秀等[13]研究和分析了纖維素酶解稻草制還原糖工藝條件。隨酶用量增加，還原糖含量明顯增加。李穗宏等[14]研究了麥秸纖維素酶解法制糖，利用3,5-二硝基水楊酸比色定糖法測(cè)定酶解液中還原糖的含量，一定的葡萄糖含量對(duì)應(yīng)著一定的光密度值,二者呈良好的線性關(guān)系。王雅晶等[15]分析了常規(guī)粗飼料干物質(zhì)、NDF、ADF降解率的評(píng)定及評(píng)定方法間相關(guān)關(guān)系，通過添加不同纖維素酶量對(duì)粗飼料干物質(zhì)、NDF和ADF消化率的影響利用平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差制定出表格，且隨著纖維素酶量增加而增大，當(dāng)酶量為一定風(fēng)干物質(zhì)時(shí)，飼料降解率可以達(dá)到最大值。本試驗(yàn)結(jié)果表明：纖維素酶水解甘蔗梢能提高還原糖生成量，極顯著降低NDF和ADF含量，且還原糖生成量、NDF和ADF含量受纖維素酶添加量影響，與以上研究基本一致。

4　結(jié)論

纖維素酶水解甘蔗梢能極顯著提高還原糖生成量，各組與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01），其他組之間同樣存在極顯著差異（P＜0.01），且還原糖生成量受纖維素酶添加量影響。

纖維素酶水解甘蔗梢與對(duì)照組先比能極顯著降低NDF含量，各處理組NDF含量分別降低了7.05%、11.67%、16.04%、16.52%、16.99%、17.46%；各處理組NDF含量第Ⅰ組和第Ⅱ組與其他各處理組差異極顯著（P＜0.01），第Ⅲ組與第Ⅵ組間差異顯著，其他各處理組間均差異不顯著（P＞0.05）；甘蔗梢酶解的最佳纖維素酶添加量為3.00 IU/g，此時(shí)NDF含量為61.80%，與對(duì)照組相比NDF降低了16.04%（P＜0.01）。

各組與對(duì)照組相比ADF的含量分別降低了1.64%、5.75%、9.68%、9.61%、10.05%、10.28%。各處理組ADF含量第Ⅰ組和第Ⅱ組與其他各處理組差異極顯著（P＜0.01），其他各處理組間均差異不顯著（P＞0.05）。甘蔗梢酶解的最佳纖維素酶添加量為3.00 IU/g，此時(shí)ADF含量為34.69%，與對(duì)照組相比ADF含量降低了9.68%（P＜0.01）。各處組甘蔗梢酶解后AIA、ADL、Ash、EE和CP含量無顯著變化。

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The Study of cellulose enzyme on the effect of enzymatic hydrolysis of sugarcane tip

He Xiaomei
（Zhongchi Animal Husbandry&Veterinary Station,Wuping,Longyan 364312）

Based on the material of sugarcane tip,this paper studied effects of different concentrations of cellulose enzyme on the effect of enzymatic hydrolysis of sugarcane tip.The results showed that when the concentration was less than 6.00 IU/g,cellulose enzymatic hydrolysis of sugarcane tip could significantly improve the amount of the reducing sugar and it along with the quantity of cellulase joins increaseing to enhance(P＜0.01).However,when the concentration was between 0 and 3.00 IU/g,cellulose enzymatic hydrolysis of sugarcane tip could significantly decrease the amount of the NDF and ADF（P＜0.01）,while between 3.00 and 6.00 IU/g, the contents of the NDF and ADF had gradually decreased along with the increase of cellulose,but the difference was not significant（P＞0.05）.This was also suggested that the optimum concentration of cellulose enzyme was 3.00 IU/g and the content of NDF and ADF was 61.80%and 34.69%.In contrast with the control group,which have reduced by 16.04%（P＜0.01）and 9.68%（P＜0.01）,respectively.In addition,different concentrations of cellulose enzyme on the contents of sugarcane tip AIA,ADL,Ash,CP,EE were not significant difference(P＞0.05).

cellulose sugarcane tip enzymolysis reducing sugar

A

1003-4331（2015）05-0024-05