鄭曉青，李 浩

(安徽醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院，安徽合肥 230022)

復方止顫顆粒由炒白芍、制何首烏、蜈蚣、丹參等十余味藥組成，是我院中醫(yī)科方劑，具有活血化瘀，柔肝通絡之功效，臨床應用近10年，對于顫病治療效果良好。何首烏為本方劑中的臣藥，而作為何首烏的主要藥效成分之一［1－2］，二苯乙烯苷的含量既是藥效發(fā)揮的關鍵，也是引起不良反應的基礎?！吨袊幍洹芬?guī)定何首烏中二苯乙烯苷含量不得低于 1.0%［3］。

二苯乙烯苷具有抗氧化、抗衰老、腦保護、降低膽固醇、抑制腫瘤等作用。近年來有報道二苯乙烯苷抗氧化同時能引起肝臟的損傷，是何首烏引起肝毒性的基礎［4－7］。因此為提高制劑安全性，減少可能引起的肝臟毒性。本課題組運用超高效液相色譜法(UPLC)對制劑中含量進行測定，以期建立快速、便捷的測定方法，加強醫(yī)院制劑質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器 超高效液相色譜儀(美國Waters公司);超聲波清洗儀(江蘇昆山超聲儀器有限公司);電子天平(百萬分之一，德國賽多利斯公司);5 mL容量瓶;圓底燒瓶。

1.2 供試藥品 復方止顫顆粒由我院制劑室提供，批號:20130425、20130711、20130906;2，3，5，4'－四羥基二苯乙烯－D葡萄糖苷對照品購自中國藥品生物制品檢定研究院(批號:110844－200607);甲醇(分析純);乙腈(色譜純);乙醇(分析純);蒸餾水。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱使用 Acquity BEH C18(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)，流動相為乙腈—水(27∶73)，流速為0.20 mL·min－1;色譜柱溫度為25℃;檢測波長320 nm。

1.3.2 對照品溶液制備 取二苯乙烯苷對照品適量，精密稱定，置5.0 mL容量瓶中，加入甲醇，超聲使其溶解，取出放冷至室溫，再用甲醇定容至刻度，搖勻得對照品溶液，濃度為0.412 g·L－1，備用。

1.3.3 制備供試品 稱取復方止顫顆粒5.0 g，研磨制成粉末狀，放置于圓底燒瓶內(nèi)，加稀乙醇100 mL，精密稱定重量，使用超聲儀超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)，1 h后取出，精密稱定，用乙醇補足重量，靜置，取上清液0.45μm過濾頭過濾，制成供試品溶液，備用。同時按照復方止顫顆粒制劑處方的比例制備缺制何首烏的樣品，按同樣步驟制成陰性對照溶液。

2 結果

2.1 專屬性考察 精密吸取對照品、供試品和陰性對照溶液各10μL注入超高效液相色譜儀中，結果顯示陰性對照溶液對測定結果無干擾。詳見圖1～3。

2.2 線性關系考察 精密量取二苯乙烯苷對照品溶液10μL，分別稀釋成梯度質(zhì)量濃度，按照“1.3”項色譜條件進樣。以二苯乙烯苷濃度為橫坐標，AUC為縱坐標，繪制標準曲線，得二苯乙烯苷的標準曲線方程為 Y=14 332 902.971X－575 593.858(r=0.999 6，n=6)。結果表明二苯乙烯苷在0.124 0～1.030 0μg范圍內(nèi)與其峰面積 AUC 呈良好的線性關系。

2.3 精密度試驗 精密吸取二苯乙烯苷對照品溶液10 μL，按照:“1.3”項下色譜條件重復6次，記錄峰面積。結果顯示精密度RSD為0.04%(n=6)，精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，室溫下按“1.3”項下色譜條件于 0、2、4、8、16、24 h 進樣 10 μL，記錄峰面積。RSD 為0.12%(n=6)，結果表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復性試驗 取同一批次復方止顫顆粒5.0 g，按“2.3”項下制備方法平行制備供試品溶液6份，照“1.3”項下色譜條件，分別精密吸取10 μL，注入色譜儀，記錄AUC。結果重復性RSD為0.19%(n=6)，結果表明本方法重復性良好。

2.6 加樣回收率試驗 取同一批已知含量的樣品6份，精密稱定重量，分別精密加入二苯乙烯苷對照品適量，按“2.3”項下制備方法制備，照“1.3”項下色譜條件注入色譜儀，記錄AUC，計算回收率，結果表明準確度良好，見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.7 樣品含量測定 取3批復方止顫顆粒各5.0 g，按“2.3”項下制備成供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件分別進樣1.0μL測定，記錄峰面積，按標準曲線計算復方顆粒中二苯乙烯苷的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

3 討論

隨著《醫(yī)療機構制劑注冊管理辦法》［8］對醫(yī)療機構制劑質(zhì)量標準要求的提高，不僅需要對制劑中的有效成分含量進行控制，更需要對可能引起藥品不良反應的成分進行控制，對于中藥復方來說，兩者往往是同時存在，發(fā)揮著兩方面的作用。近年來有關何首烏的肝毒性的報道不斷出現(xiàn)于文獻中，本制劑采用的為制何首烏，雖尚未見其有關肝毒性的報道，但對其有關成分進行質(zhì)量控制可有助于提高中藥制劑的安全性。

目前對中藥復方制劑的含量測定大多采用HPLC法，UPLC法是近些年在HPLC的基礎上才發(fā)展起來的一種新的方法和技術。與普通HPLC法相比，UPLC法具有分析時間短、分離度高等特點［9］，本文建立了復方止顫顆粒中的二苯乙烯苷超高效液相色譜測定方法，結果表明，4 min即可完成分析，可以在較短的時間內(nèi)測定制劑中的微量成分，相比文獻報道HPLC測定方法需20 min以上［10］，本研究建立的方法大大提高了分析的效率，同時節(jié)省溶劑，降低分析成本，可作為復方止顫顆粒的質(zhì)量控制方法之一。

［1］楊 杰，周芝文，楊期東，等.二苯乙烯苷對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)保護的作用機制［J］.中南大學學報(醫(yī)學版)，2010，35(4):321－328.

［2］徐 杰，周文聰，張緩英.何首烏活性成分－二苯乙烯苷的研究進展［J］.泰山醫(yī)學院學報，2008，29(1):78 －79.

［3］國家藥典委員會.中國藥典(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:164－165.

［4］高淑紅，蘇珍枝，肖學鳳.制首烏化學成分及藥理作用研究進展［J］.山西中醫(yī)學院學報，2013，13(2):74 －77.

［5］辛淑杰.何首烏的藥理作用、臨床應用及不良反應［J］.北方藥學，2013，10(7):36 －37.

［6］Aleksunes LM，Klaassen CD.Coordinated regulation of hepatic phaseIandⅡdrug－metabolizing genes and transporters using AhR － ，CAR － ，PXR － ，PPARa－ ，and Nrf2 － null mice［J］.Drug Metab Dispos，2012，40(7):1366 －1379.

［7］Sobocanec S，Balog T，Saric A，et al.Cyp4al4 overxpression induced by hyperoxia in female CBA mice as a possible contributor of increased resistance to oxidative stress［J］.Free Radic Res，2010，44(2):181 －190.

［8］國家食品藥品監(jiān)督管理局.醫(yī)療機構制劑注冊管理辦法(試行)［S］，2005－08－01.

［9］汪永忠，姜 蕾，韓燕全，等.超高效液相色譜法同時測定丹蛭降糖膠囊中丹皮酚和芍藥苷含量［J］.中國新藥雜志，2012，21(12):1337－1340.

［10］洪 燕，韓燕全，陳 楊，等.UPLC法測定黃蒲通竅膠囊中二苯乙烯苷的含量［J］.山西中醫(yī)學院學報，2013，13(5):28－30.